PCR在临床分枝杆菌菌型初筛中的应用.pdf

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1、中华检验医学杂志2013年1O月第36卷第10期ChinJLabMed，October2013．Vo1．36．No．10．短篇论著．PCR在临床分枝杆菌菌型初筛中的应用高荣操王洪秀陈晋非结核分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群(包括疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分2．试剂与仪器：改良罗氏培养基、对硝基苯甲枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌的统称，酸、噻吩一2一羧酸酰肼鉴别培养基分别由肺科医院检而非结核分枝杆菌病系由非结核分枝杆菌引起的疾验科根据《结核病诊断细菌学检验规程》配制。病。近年来，随着人口老龄化和获得性免疫缺陷综PCRMix购自

2、北京康为世纪生物技术公司。Bio-合征(acquiredimmun0deficiencysyndrome，AIDS)的BadPCR仪购自美国伯乐生命科学公司。肆虐，非结核分枝杆菌病在这些人群中有逐渐增加3．传统生化法：将分离培养阳性菌株分别接种的趋势，更进一步引起医学界对非结核分枝杆菌问于改良罗氏培养基、对硝基苯甲酸、噻吩_2．羧酸酰题的关注lL1。非结核分枝杆菌感染具有与结核分肼鉴别培养基，其中改良罗氏培养基28qC培养枝杆菌感染相似的临床表现及全身中毒症状和局部30d、其余两种鉴别培养基37℃培养30d。其中对损害，在无菌种鉴定结果的情况下，与结核病难以鉴硝基苯甲酸与改良罗氏培养基

3、28℃两者有任意一别J。许多非结核分枝杆菌对抗结核药物天然耐管生长就判别为非结核分枝杆菌群。药，不同的非结核分枝杆菌菌种对药物敏感性亦不4．DNA制备：于生物安全柜中用接种环在阳性相同，治疗方案应根据菌种而定。因此，快速、准确培养物中刮取一环菌溶解于100lTris—EDTA缓冲地鉴定分枝杆菌菌种对于疾病诊断、治疗和控制具液(TE)中，80℃灭活30min。100c(=沸水浴有重要意义。10min，冰上放置2min后16000×g离心15min，本研究选择上海市肺科医院2010至2011年L—取上清至另一EP管中，一20℃保存。J培养阳性菌株，利用PCR快速鉴别结核分枝杆菌5．引物合成

4、：针对于结核分枝杆菌特异性序列复合群和非结核分枝杆菌，和传统生化反应法进行设计引物mtbl(atagggaatgctcggcaac)和mtb2比较，同时以国际公认并广泛应用的分枝杆菌分型(caacatcgacgcagtaccc)，同时根据结核分枝杆菌复合法16SrRNA为标准，对临床常用分枝杆菌快速群特异性序列IS6110设计引物IS6110．P1(tcaggtcga鉴别法进行评估，为临床诊断和治疗提供参考。gtacgccttct)和IS6110一P2(cgtcgcagagatccgcggtc)，分别一、材料与方法扩增361和850bp两条带。1．标本来源：收集上海市肺科医院检验科自6

5、．反应程序：每个PCR管中分别加入19l2010至2011年本实验室内分离培养分枝杆菌阳性PCRMix和1lDNA模板，95℃10min，然后94℃菌株877株。标准菌株：结核分枝杆菌H37Rv株30S，55。【=30S，72℃30S，共30个循环，72cI=(ATCC27294)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC12479)、瘰7min，4℃恒温。疠分枝杆菌(ATCC23292)、戈登分枝杆菌7．结果分析：(1)如果出现了850和361bp两(ATCC14470)、鸟分枝杆菌(ATCC25291)、胞内分条带，说明模板DNA是结核分枝杆菌；(2)如果只枝杆菌(ATCC13950)、胃分枝杆菌

6、(ATCC17754)、扩增出850bp的条带，说明该菌株属于结核分枝杆不产色分枝杆菌(ATCC199530)、偶发分枝杆菌菌复合群，但不是结核分枝杆菌；(3)如果没有特异(ATCC6841)、龟型分枝杆菌(ATCC35749)由中国性条带扩增，排除DNA质量不好的因素下，则说明该菌株属于非结核分枝杆菌群。8．统计学分析：应用STATA8．0软件进行数据DOI：10．3760／cma．j．issn．1009-9158．2013．10．019处理。不同方法的计数资料采用配对设计2×2列基金项目：上海市浦江人才计划项目资助(11PJ1408200)作者单位：200433同济大学附属上海市肺

7、科医院检验科联表的精确检验，P<0．05为差异具有统计学意义。通信作者：陈晋，电子信箱：chenjindor@gmail．corn二、结果中华榆验医学杂志2013年1O月第36卷第1O期ChinJLabMed。October2013，Vd．叠．1．PCR法与传统生化法检测结果：877株培养表3PCR法与传统生化法结果比对阳性菌株中，PCR分枝杆菌快速鉴定法检出非结核16SrRNA(株)方法分矗枝杆菌枝杆菌、分枝杆菌96株，结核分枝杆菌复合群78