大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作.pdf

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1、大肠杆菌O157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。同时接种标准株H9812。第一天步骤1细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%SeakemGold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.

2、25gSeaKemGoldagarose,放入250ml的蓝色瓶内。2）加入22.5mlTE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。4）将溶解的SeaKemGoldagarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。3、在Falcon2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管

3、上标记好对应样品的名称。4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中。通过加入CSB稀释或增加菌液浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。1）用比浊仪（bioMerieuxVitekcolorimeter）测其浓度，并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位。2）用分光光度计时，在610nm波长吸光度应在1.3-1.4。3）DadeMicroscanTurbidityMeter：0.48-0.52（以Fal

4、con2054管测量）0.68-0.72（以Falcon2057管测量）注：在4.0~4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果，但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异，影响条带的识别。6、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。7、从水浴箱中取出微量离心管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml，蛋白酶K置于冰上备用。注：蛋白酶K的终浓度是指在加入400µl琼脂后的浓度。8、加入400µl的1%S

5、eakemGold：1%SDS到上述装有400µl细菌悬液的微量离心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。（此时1%SeakemGold：1%SDS需置于56℃水浴中）注：没有用完的SeakemGoldagarose可放于室温，并可重复使用1-2次。再溶时，加热时间缩短到每10-15秒一次，直至完全溶解。9、迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟。10、记录好模具内对应样品的名称。步骤2细菌的裂解1、在50ml离心管上做好样品标记。注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要

6、超过4条。2、配制细胞裂解液CLB（配制方法见附件），然后向每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注：蛋白酶K要置于冰上，配制好的蛋白酶K/CLB混合液也要置于冰上。建议配制总量后进行分装。3、每个离心管加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打开可重复利用模具，用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。保证胶块在液面下，而不在管壁上。注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。可重复利用模具需要浸于泡腾片消毒液中15分钟，然后清洗干净

7、。5、将离心管放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约130转/分钟。确认水浴箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。6、将纯水和TE放在50℃水浴箱中预热。步骤3清洗胶块1、调低水浴摇床的温度至50℃。2、从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注：可将离心管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排净。随后的操作中也如此。3、每管中加入10ml预热的TYPEONEWATER。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。注：TYPEONEWATER是水质达到18.2M欧的纯水经高压灭菌后得到的，清洗胶块以及配

8、置TE缓冲液时均需使用TYPEONEWATER。4、放回50℃水浴摇床中，转速约130转/分钟，摇10分钟。5、倒掉水，用TYPEONEWATER再洗