体外放射分析.ppt

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1、体外放射分析Invitroradioassay放射免疫分析免疫放射分析放射受体分析受体放射分析竞争性蛋白质结合分析放射性酶学分析等ZhangYongxue体外放射分析定义是指在体外条件下，以放射性核素标记的配体为示踪剂以结合反应为基础以放射性测量为定量手段对微量物质进行定量分析的一类分析方法的总称。主要方法放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为普遍。不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素等物质的测量，而且可用于具有生物活性的小分子物质的检测，如血药浓度测定等。基本原理竞争性结合分析放射免疫分析是体外放射分析最有代

2、表性的一类检测技术。放射免疫分析的基本原理是以抗原及其特异性抗体在适当的反应体系中能够发生免疫反应，形成抗原抗体复合物为基础的。K1Ag+AbAg.AbK2K1=Ag、Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数；K2=Ag.Ab复合物离解为Ag和Ab的速率常数；K1在早期明显，K2在后期明显，一定时间后达到平衡状态，两者保持相对恒定，但K1>K2。K1与K2之比为亲和力常数，Ka=K1/K2，K越大越好。K2与K1之比为平衡离解常数，Kd=K2/K1。放射免疫分析为了定量地测定待测样品中抗原的含量，如在这个体系中加入放射性核素标记的同类抗原，体系中同时存在两个平衡。Ag＋AbAg.Ab＋Ag*A

3、g*.Ab分析原理Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*.Ab复合物也减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。竞争性结合分析条件Ag*与Ag的免疫化学性质相同；Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。结合率抗体稀释度50%50％的最大结合率为抗体工作浓度标准曲线如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲线。通过这条标准曲线即可查得

4、未知浓度的待测样品的含量。B/F已知Ag浓度非竞争性分析免疫放射分析是典型的非竞争性体外放射分析。它应用标记抗体作为示踪剂，在反应系统中加入过量的标记抗体、待测物（或标准品）进行全量反应，未结合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关。基本类型以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术。免疫放射分析免疫放射分析(Immunoradiometricassay,I

5、RMA)也是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合。为非竞争性结合分析。Ag＋Ab*(过量)===Ag.Ab*＋Ab*(1)单位点法：Ag＋Ab*(过量)Ag.Ab*＋Ab*(加抗原吸附剂去除多余Ab*，上清为结合部分)。双位点法(Ab2为McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1(试管壁上)+Ag(固相)Ab1.Ag(过量)+过量Ab*2((McAb)固相Ab1.Ag.Ab*2+剩余Ab*(洗去)双位点法(Ab1为McAb)固相Ab1-McAb(试管壁上)+Ag(固相)Ab.Ag(过量)+Ab*2(过量)固相Ab1.Ag.Ab*

6、2+剩余Ab*(洗去)最后抗原被夹在两种抗体分子之间，测固相上的放射性(结合部分)。此法过量标记抗体易去除,NSB较低，灵敏度高；抗原结合部分需要有两个特定的抗原决定簇，故特性较高。标记第三抗体法与双位点法相似，只是两种抗体均不标记，而是反应结束后，加入非特异的125I-第三抗体(兔抗鼠IgG)，与抗原－抗体复合物结合，达到测量结合部分的目的。RIA与IRMA的异同均为以抗原抗体的免疫反应为基础，测定对象为物质的抗原；RIA☆为竞争性，标记物为抗原☆结合部分放射性与待测抗原浓度呈负相关,在直角坐标系呈曲线☆为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗原的量,故灵敏度较免放法低IRMA为非竞争性，标记的

7、是抗体，且为过量（高滴度）结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相关，因抗体为过量，不存在竞争结合，故结合在固相物上的放射性计数与抗原浓度呈正比，在直角坐标系近似直线；但当待测抗原浓度超过一定范围时，则正比关系消失，出现“平台效应。浓度过高出现的平台效应被测物质浓度标准曲线的有效范围结合率（%）因抗体为过量，抗原全量参与反应，反应更为迅速，灵敏度高标准曲线工作范围大由于使用单抗，其特异性好免疫放射分析仅