《体外放射分析技术》PPT课件

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1、第六章体外放射分析技术Invitroradioassay山西医科大学第二临床医学院体外分析发展史YalowBerson一、定义以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。二、分类:体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)酶免疫分析(EIA)化学发光免疫分析(CLIA)荧光免疫分析(FIA)放射免疫分析radio

2、immunoassay,RIA一、RIA的基本原理（一）竞争抑制结合反应：放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。分析原理*Ag+AbAg+*Ag-Ab+*AgAg-Ab+Ag条件：*Ag与Ag免疫活性相同*Ag与Ab恒量*Ag与Ag总量大于Ab有效结合位点Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在竟争抑制的函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*-Ab复合

3、物就减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。根据这一函数关系的标准曲线，可求出被测抗原的含量（二）剂量反应曲线：标准曲线标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。标准曲线的绘制方法用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F；分别测量B和F的放射性；用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得

4、到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。标准曲线二、RIA的基本步骤：实验由两部分组成：1.标准曲线：用一系列浓度递增的标准品（oAg），在严格相同的条件下同*Ag竞争与Ab结合反应，以oAg的剂量为横坐标，*Ag.Ab结合率（B%）为纵坐标制得刻度曲线（Calibrationcurve）；2.样本测定：同等条件下，待测样本可获得一定的B%，由此可从标准曲线上求得待测物（oAg）的含量。三、质量控制(QualityControl):目的：为了获得准确可靠的测定结果室间：某一地区/全国性机构就一些分析项目质控对各实验室所得结果进行统计比较室

5、内：实验室内部对每次分析结果的质量进行检查和控制误差：A.随机误差(RandomError)：放射性测量的统计误差不可避免，呈高斯分实验操作的实验误差布，以精密度评价试剂配制等B.系统误差(SystematicError)：通过努力可以消除由某一固定因素引起，仪器、试剂、操作程序、试验方法等主要优点：生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控制措施（QualityControl)灵敏度高：可达10-9―10-12g(mol)特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，只要含量不低于RIA探测极限，都可建立操作简便：所

6、需试剂少，测量及数据处理易于实现自动化主要缺点：灵敏度很难超过10-15g水平ThankYou!非竞争性放射免疫分析(免疫放射分析IRMA)一.基本原理：放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原呈正相关Ag+*AbAg.*Ab+*Ab(过量）(B)(F)IRMA与RIA的主要区别：RIAIRMA1.竞争性结合分析非竞争性结合分析2.三种主要反应试剂两种主要反应试剂3.标记抗原标记抗体4.复合物放射活度与复合物放射活度与待测抗原呈负相关待测抗原呈正相关5.NSB主要影响高剂NSB主要影响低剂量反应量反应

7、IRMA主要优点：温育时间短：37℃温育23小时即可灵敏度高：是RIA的10100倍测量范围宽：标准曲线工作范围宽,RIA为2个数量级，IRMA可达3个数量级特异性强：应用针对某一抗原决定簇的单抗,不易发生交叉反应IRMA主要缺点：需要二种McAb抗体用量大非放射标记的免疫分析法化学发光分析时间分辨荧光分析酶免疫分析电化学发光（ECL）：ECL是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫测定技术ECL是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明

8、显增强，因