混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响.pdf

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1、第26卷第5期2017年9月上海海洋大学学报JOURNALOFSHANGHAIOCEANUNIVERSITYV01．26．No．5Sep．，2017文章编号：1674．5566(2017)05-0776-08DOI：10．12024／jsou．20170502041混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响徐马俊坤1，冯博1，张昭寰1，孙晓红1’2⋯，潘迎捷1’2⋯，赵勇1’2’3(1．上海海洋大学食品学院，上海201306；2．上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306；3．农业部水产

2、品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海201306)摘要：以9：1和1：1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC33847：tdh+／trh一／tlh+；ATCC17802：tdh一／trh+／tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2：tdh一／trh一／tlh+；G8：tdh一／trh一／tlh+)在TSB培养基和熟虾中分别进行了混合和37℃10h的混合培养，通过菌落原位杂交技术和PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。结果显示，在TSB和熟虾中，致病菌比例均出现了下降。在熟虾样品中致病菌株下降的比例

3、更高，其中ATCCl7802和G8在熟虾样品中以9：1比例混合并混合培养10h后，致病菌比例从90％降为0。表明混合培养对致病性副溶血性弧菌菌株生长产生不利的影响，是造成水产样品中副溶血性弧菌感染频发却很难分离到致病性菌株的原因之一。关键词：副溶血性弧菌；致病性；原位杂交；菌落杂交中图分类号：TS201．3文献标志码：A副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)广泛分布于河海交界处、海水及沿海地区，是我国沿海地区引起食物中毒的重要致病菌⋯，在世界范围内也被认为是食源性疾病爆发的重要原因之

4、一心引。然而水产品及环境样品中虽然大量感染副溶血性弧菌却很难分离到致病性菌株，致病性菌株主要是从临床样品中分离得到M引。目前，分子微生物学方法取得了长足的发展，在环境和水产品中的副溶血性弧菌检测方面，DNA检测技术得到了广泛的研究和应用"剖，涵盖其检测归J、分布¨叫和异质性¨卜抡。等。很多研究报导指出，在副溶血性弧菌致病株的检测中，通过DNA方法检测相同样品获得的致病株在总数中所占的比例，要远远高于传统方法检测所获得的结果一’”1。在传统的微生物检测方法中，由于需要从背景微生物群落中单独分离致病性菌株，所

5、以必须进行较为漫长的富集培养，而DNA方法对富集培养的依赖程度则较低嵋o。然而是否培养环节对水产品和环境样品中致病性副溶血性弧菌比例造成了影响并未明确证实，可能使定量风险评估造成较大偏差。菌落原位杂交技术(Colonyinsituhybridization，ColonyISH)特异性高，检测副溶血性弧菌的同时可准确区分致病性与非致病性菌株，与成熟稳定PCR方法结合，可以更快速和准确地检测致病性副溶血性弧菌。toxR基因和￡胁基因是副溶血性弧菌的标志基因¨4

6、；而￡砒和f也基因是致病性副溶血性弧菌特有的两种

7、毒力基因0111，分别编码产生耐热性溶血毒素和相对耐热性溶血毒素，由此可以区分致病性副溶血性弧菌和非致病性副溶血性弧菌¨5

8、。本研究首先在纯培养中测试了8株副溶血性弧菌的生长速率，从中选择4株代表性的菌株以排除混合培养中菌株生长异质性的影响。再通过菌落原位杂交技术与PCR方法结合，确定了TSB培养基中混合培养前后致病菌株的比例变化，并对混合培养中的生长行为进行检测并分析原因，最后在熟虾样品中进行了混合培养实验，收稿日期：2017—05—02修回日期：2017-05-27基金项目：国家自然科学基金面上项目(

9、31671779)；上海市科技兴农重点攻关项目(2016第1一l号)；上海市教委曙光计划(15SG48)作者简介：徐马俊坤(1991一)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全风险评估。E—mail：xuma8848@163．con通信作者：赵勇，E-mail：yzhao@shou．edu．cnhttp：{

10、’啊．shhydxxb．COB5期徐马俊坤，等：混合培养对副溶血性弧菌致病株和非致病株生长的影响777以验证实际食品与富营养培养基中的差异。目的是验证水产品中致病菌低检出率的原因，正确评估副溶血性弧菌的危

11、害。1材料与方法1．1材料试剂：地高辛检测试剂盒(瑞士Roche公司)、尼龙膜(美国Sigma公司)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、硫代硫酸盐-柠檬酸盐一胆盐蔗糖琼脂(TCBS琼脂)均来自北京陆桥技术有限责任公司，其他试剂均为国产分析纯。主要仪器：HL-2000组合型分子杂交箱(美国UVP公司)、HH_4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、Bio—Tek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、58