纺锤体相关蛋白spindlin1与甲基化组蛋白复合物的结构研究.pdf

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1、分类号S512.01学校代码10129UDC65.020.20学号072020054纺锤体相关蛋白spindlin1与甲基化组蛋白复合物的结构研究StructureofSpindleAssociatedProteinSpindlin1inComplexwithMethylatedHistone申请人：王研学科门类：农学学科专业：作物遗传育种研究方向：作物种质资源研究与创新指导教师：郭世华教授许瑞明研究员论文提交日期：二〇一一年六月摘要本文利用结构生物学手段对纺锤体相关蛋白spindlin1与其甲基化的组蛋白多肽底物所形成

2、的复合物结构进行了研究。采用原核细胞大量表达的体外重组蛋白，构建了spin基因的原核细胞表达载体pET28a/SUMO和pGEX-2T，根据表达结果，确认了能够得到大量带有his-SUMO标签和GST标签的可溶性重组spindlin1。在LB培养基培养的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行了目的蛋白的大规模表达。电泳检测结果表明，在常规培养和诱导条件下（37℃培养；16℃，0.3mmol/LIPTG诱导表达），可以得到较为理想的重组目的蛋白。利用柱式层析方法分离纯化了目的蛋白，确立了稳定可重复的纯化策略，即亲和层析→

3、阴离子交换层析→凝胶过滤层析，得到了结晶纯、高浓度（约24mg/mL或0.9mmol/L）的目的蛋白溶液，并用于结晶实验。用纯化的目的蛋白产物进行结晶条件的筛选和优化，最终，确立了稳定可重复且能够形成高质量晶体的结晶条件，即：0.1mol/LCAPS，pH=11；2.0mol/L（NH4）2SO4；0.2mol/LLi2SO4；0.1mol/LGlycine，得到的蛋白质晶体适合于衍射实验。在上海同步辐射光源，利用X射线衍射法分析蛋白质复合物晶体，收集到了一套分辨率达到2.4Å的衍射数据，并据此初步解析并修正了spind

4、lin1和它的结合底物H3K4me3多肽复合物的三维结构。通过结构模型得到了关于二者相互作用的详细信息，即：spindlin1的第二个tudor结构域参与识别和结合三甲基化的赖氨酸残基，其中spindlin1上至关重要的氨基酸残基位点是（从N-端开始）Phe116，Trp126，Tyr145，Tyr152等四个带有芳香环的残基；spindlin1上的残基Tyr154和三甲基化的赖氨酸残基之间通过氢键稳定相互作用；spindlin1第二个tudor结构域中的残基Asp159和组蛋白多肽上的残基Arg2之间通过盐键稳定相互作

5、用；组蛋白H3K4me3多肽的残基Arg8或者发生甲基化修饰的残基Arg8可能会伸入到spindlin1第一个tudor结构域中来加强整体的识别和结合力的稳定性。关键词：spindlin1蛋白；亚克隆；蛋白质表达纯化；蛋白质晶体；晶体结构StructureofSpindleAssociatedProteinSpindlin1inComplexwithMethylatedHistoneAbstractThestructuresofthecomplexformedbetweenspindlin1anditssubstrate

6、ofmethylatedhistonepeptidewerestudiedbystructuralbiologymethod.ThespingenewassubclonedintheprokaryoticexpressingvectorpET28a/SUMOandpGEX-2Ttoproduceandyieldrecombinedproteinsinprokaryoticcells.Themassivesolublerecombinedtargetfusion-proteinsassociatedwithN-termin

7、alhis-SUMOtagandGSTtagrespectivelywereobtainedintheresultoftrialexpression.ThetargetproteinwaslargescaleexpressedinE.coliexpressingstrainBL21(DE3)intheLBcultured.Theresultsshowedthattheproperrecombinedtargetproteinwasproducedinroutineculturingandinducingcondition

8、s:37℃culturing,16℃and0.3mmol/LIPTGinducedexpression.Thetargetproteinwasseperatedfromthecellextractandpurifiedbycolumnchromatographymethods.Stableandrepeatablep