组蛋白磷酸化和trna甲基化相关蛋白的结构与功能研究

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1、中国科学技术大学博士学位论文组蛋白磷酸化和tRNA甲基化相关蛋白的结构与功能研究作者姓名：学科专业：导师姓名：完成时间：邵振华生物化学与分子生物学施蕴渝教授吴季辉教授二。一四年四月十五日UniVersityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationf．ordoctor’sdegreeStrUCtUreandFUnCtiOnOfPrOteinSinVOIVedinPhOSphoryIatedHiStoneAndMethyIatedtRNAAuthor’sName：ZhenhuaShaoSpeciali够：Biochemist巧&M01ecularbiol

2、ogySupeI’Visor：Prof№yuShiProfJihuiⅥ厂uFinishedtime：ALpril15廿1，2014中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人己经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：里盈二丑坠备签字日期：硼f∽石／-乙中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文

3、的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。作者签名：签字日期：口保密(年)导师签名：签字日期：摘要本论文主要研究组蛋白修饰和tRNA修饰相关蛋白的结构与功能。论文的前两章介绍了人源蛋白MCPHl串联BRCT结构域的结构与功能。MCPHl蛋白参与到DNA损伤修复过程中，它含有三个BRCT结构域，其中位于N端的第一个BIⅪT结构域与染色质重塑复合物SWI．SNF结合，并把SM．SNF复合物带到DNA

4、损伤位点，使紧密的染色质变的松散；位于C一端的第二个和第三个BRCT结构域属于串联BRCT结构域，他被证实参与结合磷酸化的组蛋白变异体H2AX(1，H2AX)。1，H2AX发生在DNA修复反应的早期并引发了下游的修复过程，在DNA的损伤修复过程中扮演着重要角色。在本论文中，通过采用X射线晶体学和生物化学相结合的方法，我们研究MCPHl串联BRCT结构域识别1，H2AX的分子机制。首先我们用荧光偏振的方法测定了MCPHl串联BRCT与vH2AX小肽的亲和力，结果表明它们之间有很强的的相互作用。然后，我们分别解析了串联BRCT以及它与丫H2AX小肽复合物的晶体结构，并与其他经典的串联BRCT结构相

5、比较，我们的结构显示MCPHl采用一种新的RXXNmotif代替RXXKnlotif来识别YH2AX。此外，MCPHl对磷酸化+3位的残基(TW，位于小肽的C末端)有选择性，它倾向于结合C末端有COOH基团的小肽，C一末端的氨基化明显减弱了它们的相互作用。我们进一步证明MCPHl串联BRCT结构域与内源性的1，H2AX有相互作用。我们的研究揭示了MCPHl串联BRCT结构域识别YH2AX的分子机理。论文的后两章介绍了酿酒酵母(勋cc办口，D聊ycPscP旭v捃f口P)tRNAmlG9甲基转移酶scTrml0的酶活催化机制。tRNA的甲基化是一种很普遍的修饰，这种修饰对tRNA的生物学功能是必需

6、的。然而鸟嘌呤G的N—l甲基化(m1G)在tRNA修饰中却比较罕见，目前在两个位点上发现了mlG甲基化：位于咖i—codon附近的m1G37和位于D．100p和acceptorstem连接处的m1G9。据最近的文献报道，Tml0家族蛋白被发现与tI矾Am1G9的形成有关，但是，该反应的催化机制以及TrmlO与底物tRNA的结合机制尚不清楚。在本工作中，我们解析了酿酒酵母scTrml0与小分子底物SAH的复合物晶体结构。通过拓扑结构分析，我们发现scTrml0的酶活结构域属于SPOUT甲基转移酶家族。因为目前已知的SPOUT家族甲基转移酶都是同二聚体，所以我们使用X射线小角散射(SAXS)的方法

7、研究了裂殖酵母spTrml0的溶液结构，结果证明SpTrmlO在溶液中呈现单体状态，而且它的N端区域在溶液中非常活跃。通过体外的酶活实验、ITC实验和分子dockiIlg结果，我们猜测两个保守残基参与了甲基转移反应：D210可能在酶摘要活反应充当着转移甲基的作用，而Q118则与tRNAG9有直接的相互作用。进一步，我们用EMSA实验证实了scTrml0的N端区域和酶活结构域的碱性区域都可以识别tI