枯草芽孢杆菌NCD-2群体感应系统comQ基因的克隆和功能分析.pdf

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1、分类号：密级：$432．1公开单位代码：学号：!QQ墨鱼2008403枯草芽孢杆菌NCD．2群体感应系统comQ基因的克隆和功能分析CloningandFunctionalAnalysisofQuorumSensingGenecomQinBacillussubtilisStrainNCD．．2学位申请人：王培培指导教!I币：董金皋教授马平研究员学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：--O----年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。。据我所知，除了文中特别加

2、以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：龟诧々乞签字日期：20i!年∥月，1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘堂．有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦盔些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、

3、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：毛诧JI毛导师签名：签字日期：2。11年‘月1日签字日期：2。／／年／月。1日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NCD．2菌株能有效的防治棉花黄萎病，明确其生防作用机理将有助于提高其生防效果。本研究对影响B．subtilisNCD．2菌株遗传转化的因素进行摸索并对其转化条件进行优化，建立了该菌株的高效电击转化体系。通过比较5个不同大小和携带不同来源复制子的质粒对其转化效率的影响，发现质粒大小与NCD．2菌株

4、的电击转化效率之间没有明确的相关性；而携带来源于B．coagulans复制子的质粒pNW33N时，NCD．2菌株的电击转化效率最高，可以达到3．6x104cfu·rtg-1DNA，说明复制子来源是影响转化效率的一个重要因素。采用pNW33N质粒在不同电阻、电场强度及培养时间下的电击转化效率的研究结果表明，该菌株转接到生长培养基后，37℃、150r·min-1培养3．5h，在电阻值200Q、电场强度14．0kV·cm-1的条件下转化效率最高，能够达到6．1×104c缸·rtg-1DNA。优化后的转化体系为llg．N丌展B．subtilisNCD．2菌

5、株的分子遗传学研究奠定了基础。细菌的群体感应系统(quorumsensing，QS)是细菌根据特定的信号分子浓度监测环境变化，并调控相关基因表达来适应环境变化的一种现象。在枯草芽孢杆菌中，QS系统调控细菌生物膜的形成，抗生素的产成及芽孢的形成等性状。QS系统包括4个基因，即comX,comQ、comP和comA，其中ComX为lO氨基酸肽，经ComQ修饰后分泌到胞外与膜上的组氨酸激酶ComP结合，ComP自磷酸化并将磷酸转移到ComA，磷酸化的ComA控制感受念形成等的一系列编码因子的转录。通过对B．subtilisNCD．2菌株进行全基因组序列分

6、析，从中定位并克隆了OS系统基因comX,comQ、comP和comA。利用同源重组技术对B．subtilisNCD．2菌株中的comQ基因进行了定位突变，获得comQ基因缺失突变体菌株M6。提取B．subtilisNCD．2野生型菌株和突变体菌株M6的脂肽提取物。平板拮抗测定结果表明突变体菌株M6的脂肽提取物对番茄灰霉病菌的抑菌效果显著降低。将脂肽提取物通过基质辅助激光解析质谱(MALDI．TOF．MS)鉴定分析表明：突变体菌株M6较NCD．2野生型菌株脂肽类物质FengycinB的产生量显著降低；M6比NCD．2多产生一种脂肽类物质Iturin

7、B。因此，推测comQ对FengycinB的产生具有正调控作用，对IturinB的产生具有负调控作用。质谱测定同时发现在NCD．2野生型菌株和突变体菌株M6脂肽提取物中均含有一类分子量较大的未知物质，但其在NCD．2野生型菌株中的浓度显著高于突变体菌株M6。说明comQ基因对于这组物质的产生有着重要影响。对NCD．2野生型菌株和突变体菌株M6生物膜的形成进行了定性检测和定量检测，结果表明突变体菌株M6的生物膜形成能力明显下降，推测群体感应系统comQ基因对生物膜的形成具有正调控作用。本研究为深入了解群体感应系统在NCD．2菌株生防中的功能提供了前提

8、依据，为明确NCD．2菌株的生防机理提供了依据。关键iT-枯草芽孢杆菌；群体感应系统；comQ,电击转化；转化效率；Clo