生物酶法催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮的研究.pdf

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1、论文作者签名：，萋二蟹指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4．评阅人5：答辩委员会主席：．工查出熬援——委员1：陈建真数援委员2：谢堙教援委员3：王丞岩副硒宜员委员4．——焦抱垡副婴塞员委员5：答辩日期：2011．05．29I㈣＼卿Y1910047杭州师范大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得揎型里至整盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文

2、中作王明确的迸胡并表示谢意．．一学位论文作者签名：孟飞签字日期：v叫1年r月弓。日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解垫必塑垫盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权垫幽!重整盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：孟7酶导师学位论文作者签名：盘8导师签字日期：洳1年r月弓o．日签字日期-哆。f．f年厂印杭州师范大学硕士学位论文致谢本论文是在导师谢恬教授的悉心指导下完成的。三年的硕士

3、学习生活即将结束，能有幸得到恩师的教诲，是学生受用不尽的宝贵财富，在此，谨向谢恬教授表示衷心的感谢!此外，俞春娜博士在过去三年中给予了我无微不至的指导和帮助，使我能够顺利完成硕士论文，祝俞老师今后工作顺利、生活幸福。本论文的完成亦得感谢李海峰博士、张顺成同学和朱建华师弟等的大力帮助。李博在蛋白纯化和酶催化方面给予了我很多指导；张顺成同学在酶活检测和蛋白电泳实验中提供了大量的帮助及便利；和朱建华师弟相处的时间不长，但他的认真以及安静给我留下了很深刻的印象，其实这才是实验室中需要的人才。感谢杨兵和杜鹏飞两位师兄，很高兴能在杭州见到两位安大学长，在我刚进入实验室阶段，是他们耐心

4、地教会了我基本的实验操作及仪器使用。感谢生物医药与健康研究中心的所有老师，和在此工作的实验人员。感谢熊小龙、金鹏、张方凯、陈飞飞、周秀玲、高允允、王秋艳、赵金刚、袁通、陈森林、周硕、翟晓红和肖仁钟等等师弟师妹，在此不能一一将你们的名字写下，平时的实验中也没少麻烦你们，希望你们在接下来的时间里能取得很好的成绩，收获自己想要的结果。感谢韩来红、陈亮文、温汉华、叶听、潘园园、韩风、张顺成和吕丹青等同学，两年的日子里，大家一起经历了许多风风雨雨。学习之余能和韩来红谈论NBA和欧洲足球联赛，每天晚上能和陈亮文一起跑步，也从温汉华身上学到了很多学校里和书本上学不到的知识。感谢生命与环

5、境科学学院的周振华、王震、张大卫、胡旭、孟莎莎、赵红燕、朱江敏、朱胜男、沈少华、徐京、杨杨、张华美、刘慧娟、黎乾和郭丹等等同学，研一时的集体活动以及后来的多次聚会让平凡的学习生活充满了色彩。“感谢向太和、王慧中两位老师，以及樊叶杨、庄杰云老师，还有鲍钱江师兄，你们在我的研究生初期给予了我很大的帮助和指导，在此表示衷心的感谢。孟飞2011年3月于杭州仓前杭州师范大学硕士学位论文摘要倍半萜烯类化合物(sesquite叩ene)及其衍生物广泛分布于自然界中，是植物精油的重要组分之一，很多倍半萜化合物具有明显的生物活性和应用价值。圆柚酮((+)．nootkatone)，属于倍半萜

6、化合物瓦伦西亚烯的酮类衍生物，具有独特的芳香气味，作为重要的香料原料在食品、日用品、化妆品以及烟草等等行业中有着广泛的应用，具有很高的市场价值。圆柚酮在天然精柚中的含量很低，再加上其立体异构体以及众多萜烯类化合物的存在，一般很难直接分离获得，圆柚酮的天然提取路线不具有商业价值。目前，工业上常通过化学氧化价格相对便宜的瓦伦西亚烯((+)．valencene)来获得圆柚酮，但在这过程中往往使用一些具毒性或污染性的氧化剂，对环境造成严重的危害。近十几年来，采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为这一领域研究的新方向，特别是利用细胞色素P450BM-3(c”ochromeP45

7、0BM．3，CYP450BM．3)对瓦伦西亚烯进行氧化，已成为获得圆柚酮的一条潜在途径。来源于巨大芽孢杆菌(B口cf跏肌昭口fP一”m)的CYP450BM．3是CYP450家族当中特殊的一员，因其亚铁血红素结构域和负责电子转移的FAD／FMN还原结构域都包含在同一条肽链中，因此该酶在进行催化时无需CYP450还原酶的辅助作用，这个独特的性质使它具备了开发成为工业用P450酶的潜力。以定点突变、易错PCR和体外同源重组技术(DNAshummg)等等为代表的定向进化技术已被用于对CYP450BM-3进行改造，以期获得对非天然底物具