荧光定量pcr设计方案

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1、荧光定量PCR实验方案设计流程1)、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在genebank中找到相应基因序列。2)、用引物设计软件Primer5.0、Oligo6.0或beacondesigns3.0进行引物探针的设计；引物设计通常遵守如下原则：A、引物与模板的序列要紧密互补。B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免

2、出现3个以上连续相同的碱基。F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子探针设计通常遵守如下原则：A、探针位置尽可能地靠近上游引物。B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC含量在40%－70%。C、探针的5’端应避免使用碱基G。D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。3）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(www.ncbi.nlm.nih/blast)4）、根据仪器特点和个人的喜好，选择标记的荧光素种类。如：FAM、Texa

3、sred、LC-Red640，LC-Red705等，同时确定荧光定量PCR的方法，选择Taqman或beacon等，可参考前面所述。5）、选择高品质的引物探针合成商，如闪晶生物等。6）、外标准品的制备：一种是化学合成目的基因，它的优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成120bp以下的长度；一种是将PCR扩增产物直接梯度稀释，它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定；另一种是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，它的优点是稳定、准确。如果是转基因食品，则要求转基因食品与非转基因食品按一定的比例混合

4、做成标准品。稀释液可以是TE缓冲液。拷贝数＝（质量分子量）×6.0×1023。通常外标由4个点到5个点组成，模板的浓度分别为107/ml、106/ml、105/ml、104/ml、103/ml。7）、合成好的引物探针，最好用双蒸水稀释成25pmol/ul的浓度，然后放－20℃保存，还应该注意避光保存探针。如果是配成25pmol/ul的浓度，那么所加水的量是（ul）：(OD数×33)分子量×400008)、PCR反应液的配制1×PCRbuffer、0.3-0.5pmol/ul的引物、0.1－0.3pmol/ul的探针、2.5-4.0mM的Mg2+、1-2U的T

5、aq酶、0.2－0.4mM的dNTPs、0.2-1U的UNG酶、0.3-0.6mMdUTP、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul（以上所有的浓度都是指终浓度）9)、PCR扩增程序的设定在lightcycler上通常是：先50℃2分钟、再93℃3分钟，然后93℃5秒60℃20秒，循环40次，在60℃时，设定荧光检测点在其它荧光仪器上，通常是：先50℃2分钟、再93℃5分钟，然后93℃20秒、60℃30秒，循环40次，在60℃时，设定荧光检测点。10）、基线或阀值的设定通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线

6、。