pull down流程和结果模板.doc

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1、广州辉骏生物科技有限公司Pulldown一、原理Pull-down又叫做蛋白质体外结合实验，是在外源条件下检测蛋白质间相互作用的方法。基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的结合蛋白，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，验证两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白；“诱饵蛋白”一般采用原核表达（也可以通过其他方式）获得，而“捕获蛋白”可以是细胞裂解物、纯化蛋白或表达系统获得的蛋白。二、实验流程1、构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体（带his或GST标签）；2、载体转化大

2、肠杆菌，表达诱饵蛋白（这一步比较关键，很多蛋白原核表达会形成包涵体，极大影响后续实验，我们采用自诱导培养基培养细菌，使得包涵体形成的几率大大降低）；3、裂解细菌，裂解液过柱子（特异结合his或GST标签）；4、待测样品裂解，裂解液过柱子，互作蛋白被吸附在柱子；5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；7、下一步根据实验目的可以去做Westernblot或质谱1）如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则拿上一步的蛋白复合物去孵育X的抗体，做Westernblot；2）如要寻找诱饵蛋白的所存在的可能的互作蛋白，则拿上一步的蛋白

3、复合物去做LC-MS/MS，对照组、实验组的复合物分别做LC-MS/MS；三、结果GST：对照；GST-X：实验；Y：目的蛋白溶液图1pulldown验证两个蛋白互作结果Pulldown寻找互作蛋白的结果是两组质谱结果，可参考TAP/MS的结果。