GST-pull-down-方案-方法-流程.doc

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1、GST-pulldown技术一大量制备GST蛋白1活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。（IPTG0.5mM，20℃,150rpm培养10~16小时）4诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬6冰上超声沉淀重悬液：2S间隔1S至悬

2、液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声６～９min可透明）710,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml细菌培养物可以用50ul匀浆）3每1.33mL初始匀浆加入10mL4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4每1.33mL初始匀浆加入1mL冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。（50ul初始匀浆加入40ulPBS

3、）三结合GST蛋白1上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。24℃，500g离心5min后弃上清3沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)44℃，５00g离心5min后弃上清5重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。（需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于1*106~1*107个细胞的裂解液。）

4、2离心，4℃，13，000rpm*2min3将上清转移到新的离心管中五探测细胞裂解液1设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4℃翻转混合孵育2h（时间可适当延长，如过夜以让其充分结合）2离心，4℃，13，000rpm*2min3用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤，4℃，13，000rpm*2min，弃上清，重复洗三次4加入50ul的2*LoadingBuffer。轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清。SDS-PAGE分离相互作用蛋白Western-Blot检测靶蛋白