蛋白相互作用Pull-Down实验.doc

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1、蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料

2、：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：BindingBuffer/WashingBuffer:4.2mMNa2HPO4、2mMKH2PO4、140mMNaCl、10mMKClSDSloadingBuffer:50mMTris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mMDTT裂解缓冲液：20mMTris-Cl(pH8.0)、200mMNaCl、1mMEDTA（pH8.0）、0.5%NonidetP-40使用前加入加入蛋白酶抑制剂。（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7u

3、g/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ugGST在4℃混合孵育2h。离心机12,000g在4℃离心2min。将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。最大速度在4℃离心样品2min。在新的微量离心管中收集上

4、清。用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。重复洗三次。加入50ul20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。将洗脱蛋白质与等体积的2×SDS-PAGE上样buffer混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4℃孵育结合30min。2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。3、3000rpm在4

5、℃离心5min，除去上清。4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。方法三：实验试剂：PBS（140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4）ElutionBuffer:50mMTris-Cl(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽0.154g溶解到50ml50mMTris-Cl(pH8.0)中配制ElutionBuffer。1、细胞裂解取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀

6、。将其在室温下晃动孵育20-30min。2、固定GST融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上清，加250ulBindingBuffer或washBuffer到凝胶中，混匀。重复洗3次以上。平衡好的凝胶用100ulBindingBuffer或washBuffer重悬。加200ul含GST融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。小心移去上清，（保存以便分析，）将250ulBindingBuffer或washBuffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBindingB

7、uffer或WashingBuffer再次清洗，将凝胶用20ulBindingBuffer或washBuffer重悬。1、捕获猎物蛋白将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ulBindingBuffer或washBuffer和20ul10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵育1h。移去上清。将400ulBindingBuffer或washBuffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min，移去上清。加400ulBindingBuffer或washBuffer再次清洗凝胶。小心移去上清。分析：加20ulSDS-PAG