GST pull-down实验技术

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1、GSTpull-down实验技术主讲：段志强GSTpull-down原理GSTpull-down实验流程GSTpull-down原理：GST pull down是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。原理：利用DNA重组技术将已知蛋白与GST(GlutathioneStransferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。GSTpull-down原理：基本原理：假定A蛋白

2、和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Westernblotting检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因相互作用而被GST-A pull-down；而GST对照组始终仅有一个条带。GSTpull-down示意图GSTpull-down应用用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白GSTpull-down

3、流程GST-A融合蛋白的制备B蛋白的制备体外蛋白的结合Westernblot检测1.1GST-A融合蛋白的表达1.2GST-A融合蛋白的纯化1.GST-A融合蛋白的制备1.1GST-A融合蛋白的表达1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp＋)，37℃，200rpm培养过夜；2、将过夜培养物按1:100比例接入200mlLB(Amp＋)，220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IP

4、TG0.5mM，20℃，200rpm培养10~16小时）;4、诱导适当时间后，4℃，5000rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；1.1GST-A融合蛋白的表达5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔5S至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声6~9min可透明）;7、12000rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L。1.2GST-A

5、融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%GlutathioneSepharose4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；2、3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合了GST-A融合蛋白。3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清;4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结

6、合有GST-A融合蛋白的Sepharose；1.2GST-A融合蛋白的纯化5、如果用于检测，在Sepharose加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。6、12000rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。B蛋白的来源：1.1(His)-B融合蛋白的原核表达与纯化1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达2.B蛋白的制备1、活化冻存菌种His和His-B：按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp＋)，37℃，200rpm培养过

7、夜；2、将过夜培养物按1:100比例接入200mlLB(Amp＋)，220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG0.5mM，28℃，200rpm培养10~16小时）;4、诱导适当时间后，4℃，5000rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔5S至悬液透明（

8、一般可溶性蛋白：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声6~9min可透明）;7、12000rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L。1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子，4℃缓慢摇动，反应30~60min；2、3000rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠