检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

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1、(C)蛋白质相互作用绿色荧光蛋白被激发，检测到绿色荧光Op/UAS(基因被激活)一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①FRE丁技术(invivo)FRET,Fluorescenceresonanceenergytransfer,即焚光井振能策转移技术◊该技术的原理足用-种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另-•种荧光蛋白，使邦释放另一波长的荧光，如卜阁所示.•400-430nm470-480nm530nmCFP：蓝绿色荧光蛋白YFP:货色荧光蛋白以下阁为例，苦要利川FRET检测两种蛋白足否打相瓦作川，苫将两种蛋

2、白的某因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内农达出两种融合蛋白。然后只芯用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP足否放出绿色荧光。如聚能检测到绿色荧光，那么讨以说明这两种蛋白川能冇相互作川；反之，则足这两种蛋白没苻相互作川。放出绿光(B)没有蛋白质相互作用绿色荧光蛋白未被激发，只检测到蓝光②酵付双、三杂交技术(invivo)解母双杂交系统主要用于考察两种蛋白趟否有相互作用，其原理足典型的與核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具狗这两个结构域时才能起始转录。山此

3、，没计不同的两个裁体，一个含有AD祯因(假设为A战体)，另一个含有BD祯因(假设为B载体)。-•般将一个已知进白的基因连在B载体上,作为诱饵(Bait).将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与己知蛋白足否冇相互作用。如來两杏有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上菇现出來或者生存下來:如果网者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法往择培养基上显现出來或荇生存下來，如下阁所示：(C)蛋白质相互作用绿色荧光蛋白被激发，检测到绿色荧光

4、Op/UAS(基因被激活)一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①FRE丁技术(invivo)FRET,Fluorescenceresonanceenergytransfer,即焚光井振能策转移技术◊该技术的原理足用-种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另-•种荧光蛋白，使邦释放另一波长的荧光，如卜阁所示.•400-430nm470-480nm530nmCFP：蓝绿色荧光蛋白YFP:货色荧光蛋白以下阁为例，苦要利川FRET检测两种蛋白足否打相瓦作川，苫将两种蛋白的某因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内农达

5、出两种融合蛋白。然后只芯用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP足否放出绿色荧光。如聚能检测到绿色荧光，那么讨以说明这两种蛋白川能冇相互作川；反之，则足这两种蛋白没苻相互作川。放出绿光(B)没有蛋白质相互作用绿色荧光蛋白未被激发，只检测到蓝光②酵付双、三杂交技术(invivo)解母双杂交系统主要用于考察两种蛋白趟否有相互作用，其原理足典型的與核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具狗这两个结构域时才能起始转录。山此，没计不同的两个裁体，一个含有AD祯因(假设为A战体)

6、，另一个含有BD祯因(假设为B载体)。-•般将一个已知进白的基因连在B载体上,作为诱饵(Bait).将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与己知蛋白足否冇相互作用。如來两杏有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上菇现出來或者生存下來:如果网者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法往择培养基上显现出來或荇生存下來，如下阁所示：酵母双杂交系统UAS:h.游激活序列BD：DNA结合结构域AD：转泌激活结构域报告基因由于酵母双杂交系统不能

7、鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：无转录无转录转录启动如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转求(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用)。将该C端段连到一个脱蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个脱蛋甶有相互作用，那么两个脱蛋白在相互靠近时会使泛索蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛索蛋门。此时泛索蛋白酶体会将这•-段被泛索标记的片段降

8、解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即讨进入细胞核启动标记基因的表达。酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研宂的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以进：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：如上阁所示，在加入第三种成分前，进白X与蛋白Y之间并无