DNA提取试剂盒步骤--最新.docx

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1、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）储存条件该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。注意事项1．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。2．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。3．若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。4．所有离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心。操作步骤使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中

2、加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。1.处理材料用干烤过的镊子和剪刀剪取一定量的冰冻组织，体积约两个绿豆大小，放入DNAase-free的1.5mlEP中。向EP管中加入等体积的磁珠，以及加入200μl缓冲液GA，振荡悬浮。置于组织破碎仪中运行5mins/次，共3次。每破碎一次，需将含组织的EP管放入离心机中短暂离心来沉淀组织和磁珠，使其在下次破碎时更好的接触。可根据观察匀浆的效果来决定匀浆的次数，目标是“碾磨均匀”，不能有较大体积的组织块（>2mm的组织块）。如果需要去除RNA，需加入4μlRNaseA（100mg/ml）溶液（客户自备，目录号：RT405-12），振荡15

3、sec，室温放置5min。2.加入20μlProteinaseK溶液，混匀。提取组织基因组时，加入ProteinaseK混匀后，在56℃放置1~3h，直至组织溶解，每小时颠倒混合样品2-3次，用水浴振荡器也可。放入10,000rpm(~11,500×g)的离心力高速离心1mins来沉淀未碾碎的组织和磁珠。将上清转移至新的EP管中。3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和

4、提取出的DNA不纯。4.加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,4

5、00×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8.重复操作步骤7。9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置5mins，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μ（100ul）洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组D

6、NA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。11.溶解的DNA样品其A260/280比值<1.7~1.9。将DNA溶液放入-20°C冰箱中保存。若要长期保存DNA样本，最好加入相应2.5倍体积的无水乙醇来沉淀DNA。混匀后便可看见白色絮状物。短暂离心后放置于-80℃低温

7、冰箱中保存至少一年。若需使用，需在7000~8000×g的离心机中离心5min，使DNA重新沉淀，再加入TE溶液溶解DNA沉淀。必要时须重新检测DNA的纯度和浓度。DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。DNA:OD260/OD280比值应接近1.80，若R值大于1.8。