初选培养基实验方案.doc

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1、初选培养基实验方案一、主要试剂药品羧甲基纤维素钠粉(CMC-Na)，吐温-80，K2HPO4KH2PO4,NaNO3KCl,CaCl，MgSO4,FeSO4,微晶纤维素粉，刚果红，麸皮，（NH4）2SO4,NaCl，去皮马铃薯，麦芽糖，蛋白胨，酵母膏，1mg/ml标准葡萄糖溶液，1％CMCNa底物溶液，柠檬酸柠檬酸钠，乙酸乙酸钠，酒石酸钾钠，NaOH,石碳酸，无水亚硫酸钠，无水葡萄糖。二、采样动物粪便，动物饲料（以玉米秸秆为主），土层。(100g—200g)三、培养基初筛培养基一:梭甲基纤维素钠培养基（细菌

2、，真菌鉴别）。参考查氏培养基，用梭甲基纤维素钠取代其中的蔗糖，通过观察培养基上的菌落周围有无水解圈，以及水解圈的大小和清晰程度，并经反复试验后，最终确定梭甲基纤维素钠添加量为5g，其余配方不变。并用稀盐酸调节PH在5.5一6.0。梭甲基纤维素钠5g;KH2PO4lg琼脂17gNaN033gKCL0.5gMgS040.5g蒸馏水l000mlFeso40.01g(调pH在5.5一6.0。于121℃，0.llMpa下灭菌30min备用)。注：如果不调梭甲基纤维素钠培养基的PH值则较适合用于产中性纤维素酶菌株的筛选

3、，比如长梗木霉、腐殖菌、芽抱杆菌等。如调PH值在5.0一6.0之间较适合用于产酸性纤维素酶菌株的筛选，比如绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、青霉等。初筛培养基二:纤维素刚果红鉴别培养基I。（放线菌鉴别）。参考各种纤维素刚果红鉴别培养基的配方，通过观察菌落周围水解圈的形态，经反复试验后确定微晶纤维素粉的添加量为5g一20g。微晶纤维素粉5.0g（NH4）2SO42g刚果红0.2gKH2PO41g琼脂20gNaCL0.5g蒸馏水1000mlMgSO40.5g(自然PH。于121℃，O.11Mpa下灭菌30m

4、in备用)。I初筛培养基三:纤维素刚果红鉴别培养基。微晶纤维素粉20g（NH4）2SO42g刚果红0.2gKH2PO41g琼脂20gNaCL0.5g蒸馏水l000mlMgSO40.5g(自然pH。于121℃，0.llMpa下灭菌30min备用)。初选培养基四：改良细菌刚果红纤维素琼脂培养基:K2HPO40.5g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4.7H2Oo.25g/L，微晶纤维素粉1.88g/L，刚果红0.2g/L，琼脂18g，pH值自然，12l℃灭菌20min。马铃薯麦芽糖琼脂培养基：（斜面活化

5、保藏培养基）:去皮马铃薯200g，麦芽糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。(自然PH值。于121℃，0.llMpa下灭菌30min备用)。初选培养基五：高氏1号琼脂培养基（放线菌分离培养基）可溶性淀粉2%，KNO30.1%，NaCL0.05%，K2HP040.05%，MgSO40.05%，FeSO40.001%，琼脂2%初选培养基六：秸秆腐解琼脂培养基（放线菌分离培养基）称150g堆腐至发黑发粘呈半腐解状态、晒干粉碎的玉米秸秆腐解物粉于1L自来水中煮沸30min,过滤后加K2HPO40.5g,MgSO

6、4·7H2O0.5g,琼脂18g,加水定容至1L.配制好后1×105Pa30min灭菌,冷却至50℃～60℃按不同处理加入抑制剂倒板备用。四、实验步骤1.在校园内采集各种树木底下(避开松树)和灌木丛下面距土地表层5cm处的潮湿的土样、枯枝落叶样、朽木样、植物残体，以及草丛中距土地表层5cm处的潮湿的腐质土样.2.以无菌方法称取0.3克样品，剪碎研磨后，加入装有100ml灭菌生理盐水，并带玻璃珠的三角瓶中充分摇振溶解，并浸泡几小时。上清液用无菌水10倍递增稀释，稀释倍数分别是10/100/1000倍。3.配制

7、好初筛培养基，并调节PH值，灭菌后趁热摇匀倒平板，培养基厚度约0.6cm左右。放置冷却凝固。4.将各稀释度样品溶液涂布到初筛培养基一、二、三、四、五上，待初筛培养基上的水份稍干后，放于恒温培养箱中28℃倒置培养4一5天。4一5天后，选择四周有较大透明水解圈的菌株于初筛培养基上划线分离，得到纯培养。5.将纯化后的菌株点种到初筛培养基上，28℃培养4天左右，根据水解圈直径似)与菌落直径(c)的比值HC的大小确定初选菌株。同时挑选了个别无水解圈但生长旺盛的菌落。6.采用刚果红染色法观察初筛培养基一上分泌纤维素酶的

8、菌落周围的透明水解圈。初筛培养基二、三、四上出现的透明水解圈直接观察。刚果红染色法:在初筛培养基一上涂样第4一5天后，已有菌落长成，往选择平板中加入适量lx10一3g/ml刚果红溶液。染色1h，弃去染液后，加入适量lmol压的NacL溶液，洗涤lh。菌体若能分泌纤维素酶，则在菌落周围会出现清晰的透明水解圈，依据透明圈与菌落直径比值大小选择产酶菌落。7.将最终确定的初选菌株从初筛培养基上点种到斜面活化保藏培养基上，