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1、云南大学学报(自然科学版),2002,24(5):388～392CN53-1045/NISSN0258-7971JournalofYunnanUniversityX生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究孙明波,李卫东,吴炳元,余华,衡燮,廖国阳,姜述德(中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所,云南昆明650118)摘要:在搅拌式生物反应器中,应用批培养、流加培养和灌流培养3种方法对CHO-k1细胞进行了培养.3666-1种方法最大活细胞密度分别达到了2.0×10,2.7×10和9.6×10mL.对培养过程中葡萄糖和氨基酸及代谢产物氨和乳
2、酸的动态变化进行了检测和分析.结果表明,CHO细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的摄取以及氨和乳酸的产生与培养液中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度正相关,培养过程中控制葡萄糖和谷氨酰胺的加入量能够明显降低氨和乳酸的产生,提高代谢效率,增加细胞产量.关键词:CHO-k1细胞;生物反应器;生长;代谢中图分类号:Q251文献标识码:A文章编号:0258-7971(2002)04-0388-05CHO-k1细胞作为基因工程的受体细胞,已1.4培养方法经表达了许多制品,如UK,t-PA,和乙肝基因工(1)批培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺浓度分程疫苗等.利用CHO细胞表达生物制品,
3、是目前别为17和4.5mmol/L,微载体加入3g/L,细胞接[1,2]5-1生物工程研究的重要课题之一.生物反应器大种量为1.5×10mL.细胞和培养基一次性加规模培养细胞技术的应用,对于用CHO细胞大量入,培养至138h结束.制备各种制品有着十分重要的意义.为此,我们用(2)流加培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺浓度搅拌式生物反应器,采用不同培养方法培养了分别为12和2.5mmol/L.流加液含葡萄糖100CHO细胞,对发酵过程中细胞的生长、营养物质代mmol/L,谷酰胺80mmol/L.微载体加入3g/L.培谢等进行了研究,为优化培养条件,探索较
4、为合理养至34h开始流加,流加量随培养时间的延长而的培养方法打下基础.逐渐增加,由0～1mL/h,培养至158h结束.(3)灌流培养:培养基中葡萄糖和谷酰胺分别1材料和方法为12和4mmol/L,微载体加量5g/L.灌流液组分1.1设备荷兰Applikon发酵罐,工作体积2L.与培基相同,灌流量随培养时间的延长而逐渐增培养时,自动调节氧气、氮气、二氧化碳、空气的混加,由0～84mL/h.合比例以及碳酸氢钠的加入量来控制溶氧和pH1.5发酵控制3种培养方法,培养过程中,pH值.控制在7.2,温度37℃,溶氧40%空气饱和度.接1.2细胞和培养基CH
5、O-K1细胞来源于武汉种细胞时搅拌速度为40r/min,24h后逐渐加大到大学中国典型培养物保藏中心70代细胞,培养时60r/min.为75～77代.培养基为SigmaDMEM/F121∶1,用1.6贴附细胞计数离心管中加入4mL发酵样时加入体积分数为10%新生牛血清,青链霉素各品,静置片刻,待微载体沉降后,轻轻吸净上清.加为100U/mL,根据不同的培养方式加入不同量的入结晶紫染液至4mL,混匀.于37℃放置45min葡萄糖和谷氨酰胺.以上.之后摇动使其混匀,稍置片刻,待微载体沉降1.3微载体使用PharmaciaCytodex-1微载体.后,
6、取上清,用血球计数器计数.X收稿日期:2002-02-16基金项目:云南省科技计划新药专项项目(2000XY05).作者简介:孙明波(1969-),男,云南人,硕士,助理研究员,主要从事病毒疫苗方面的研究.第5期孙明波等:生物反应器培养CHO细胞的生长与代谢研究3891.7检测取各培养不同时段的培养液,于1000(mL).r/min离心10min,上清保存于-20℃待检.葡萄2实验结果糖含量用Sigma16-UV检测,乳酸盐用Sigma826-UV检测,氨用Sigma171-UV检测.氨基CHO细胞批培养、流加培养和灌流培养细胞555酸采用Wat
7、ersAccQ.Tag试剂包,在Backman接种密度分别为1.5×10,1.2×10和1.2×10-1HPLC上用C18反向柱层析分析,分析方法在操作mL,随着培养的进行,细胞密度逐渐增加,在培手册的基础上有所改进,洗脱液成分也进行了改养的中后期达到最大值.3种方式培养的活细胞密666良.度最大分别达2.0×10,2.7×10和9.6×10-1dNt1mL.之后,批培养和流加培养的细胞密度开始下1.8发酵参数计算比生长率μ=+dtNv降,直至培养结束(图1a).三者细胞比生长率μ的F,N:总细胞密度(活细胞+死细胞)(mL-1);变化情况大致相
8、同,它们都是在培养开始后不久,tV即在培养47,16和38h(之前未取样)分别达到最-1Nv:活细胞密度(mL);t:培养时间(h);F
