丁酸钠和丙酸钠对工程cho细胞生长

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1、丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响*马军董艳秋邹珉程联胜刘兢**（中国科学技术大学生命科学学院合肥230027）摘要抗p185erbB2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象，分别用不同浓度丁酸钠（0~2mmol/L）和丙酸钠(0~10mmol/L)对处在对数生长期的细胞进行处理，在连续5d的培养过程中，每隔24h取样测活细胞数量，并用ELISA检测上清中抗体含量，5d后结束培养用FACS检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90％满度的细胞，然后每隔12h取样一次检测葡萄糖

2、和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达，表达量最高时可达58.3~59.6mg/L，是对照组的1.5倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期，并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比，丙酸钠具有较小的细胞毒性，是一种有潜力的替代品。关键词丁酸钠丙酸钠CHO细胞嵌合抗体收稿日期：20050429修回日期：20050712*国家“863”计划资助项目(2004AA215260)**通讯作者，电子信箱：jliu@ustc.edu.cnCHO细胞的蛋白表达加工能力较强，因而常用来表达外源重组蛋白。有

3、研究表明，一种小分子短链脂肪酸－丁酸钠可以提高多种外源蛋白在CHO细胞中的表达量，比如凝血Ⅷ因子［1］、组织纤溶酶原激活物(t-PA)［2］、促红细胞生成素(EPO)［3］、人血小板生成素(hTPO)［4］及一氧化氮合成酶(NOS)［5］等。表达量提高的程度因表达产物的不同而有差异。同时研究还显示丁酸钠可以抑制细胞生长,阻断细胞周期，诱导细胞凋亡等。另有报道，同属于短链脂肪酸的丙酸钠也可以提高CHO细胞中外源蛋白的表达量,比如Ⅷ因子［6］和胰蛋白酶抑制因子(AAT)［7］。p185是由癌基因HER-2/ebB2编码的分子量为185kDa跨膜蛋白，属表皮生长因子受

4、体家族。一些肿瘤患者，尤其是乳腺癌患者，被发现存在有p185的过度表达［8］。1998年美国Genetech公司研发出第一个人源化的抗p185工程抗体药物—Herceptin，并经FDA批准投入临床应用，用于治疗p185高表达的乳腺癌。抗体药物开始成为生物制药中一个引人注目的发展方向，但由于抗体药物临床治疗剂量较大，如何高效表达抗体就成了一个重要的研发环节。本实验室在自主研制的抗p185单克隆抗体的基础上，构建了一个分泌型muScFvhuFc人鼠嵌合抗体，体内外活性检测显示其具有良好的肿瘤细胞生长抑制活性。通过在CHOGS表达系统下逐步加压反复筛选，得到一株

5、稳定表达嵌合抗体的工程细胞株,表达量为5~7mg/d/106细胞［9,10］。本实验中我们用不同浓度的丁酸钠和丙酸钠对此工程细胞株进行处理，在有血清的培养条件下观察和比较它们对细胞生长代谢和嵌合抗体表达量的影响，为优化大规模制备抗体工艺进行了探索。1材料与方法1.1细胞株与细胞培养稳定分泌表达抗p185的人鼠嵌合抗体的工程CHO细胞株由本实验室构建［9,10］。工程CHO细胞株常规培养在100mlFlask（Nunc公司产品）瓶中，置于37℃，5％CO2及一定湿度的培养箱中，培养基成分如下：不含谷氨酰胺的DMEM培养基（GIBCO公司产品）添加5％透析过的（v/

6、v）的胎牛血清（杭州四季清公司产品）和1％（v/v）的非必需氨基酸（GIBCO公司产品）以及各600mg/L的谷氨酸和天冬氨酸,各35mg/L的核苷酸（腺苷酸，鸟苷酸，胞苷酸，尿苷酸，胸苷酸）。2005,25(10)马军等：丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.1020051.2丁酸钠或丙酸钠处理一定量的丁酸钠和丙酸钠（Sigma公司产品）溶于PBS中配成浓度分别为1mol/L的贮液，0.22μm膜（millipore公司产品）滤过后保存于4℃冰箱。细胞按以下方法处理：(1

7、)5×105个细胞接种于100mlflask瓶中，第二天贴壁后换成新配制的含不同浓度丁酸钠（0,0.2,0.5,1,2mmol/L）或丙酸钠（0,1,3,6,10mmol/L）的培养基，按不同浓度各分5组，每组15瓶，以后每隔24h每种浓度各取3瓶进行细胞计数和表达量测定并取平均值，5d后结束时检测细胞周期。(2)5×105个细胞接种于100mlFlask瓶中，长至90％满度后，实验组换成新配制的含1mmol/L的丁酸钠或6mmol/L的丙酸钠的培养基,对照组也同时换液但不予添加丁酸钠或丙酸钠，每种浓度设3个平行对照，以后每隔12h各取微量上清进行葡萄糖和乳酸分

8、析并取平均值。1.3细胞