组织总RNA的提取.doc

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1、实验五植物组织总RNA的提取一、实验目的：RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。通过本实验掌握利用Trizol法提取植物总RNA的方法和步骤。二、实验原理：　　TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。二．样品提取：　1、将组织在液氮中磨成粉末，加入TRIzon溶液，每50-10

2、0mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、样品中加入TRIzon后反复吸打，使样品充分裂解，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。　3、每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，放置2-3分钟。4、4℃，12000rmp离心15分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相。取上层水相于一新的离心管。5、在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，12000rmp

3、离心10分钟。　6、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇对沉淀进行洗涤。7、4℃，12000rmp，离心3分钟，小心弃去上清液，勿弃RNA沉淀。8、室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，得到的RNA保存在－80℃，防止降解。三、注意事项：　1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。　3、在收

4、集到生物材料之后，最好能即可进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将材料急速冷冻后，储存于-80℃冰箱。在制备RNA时，将储存于冰箱的材料取出，立即加入液氮研磨，绝不可以先行解冻。