病毒载体概述教学内容.doc

《病毒载体概述教学内容.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、病毒载体概述精品文档病毒载体概述引言基因导入系统（genedeliverysystem）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关

2、系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又

3、可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，

4、病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。然而，这样的重组病毒作为基因转

5、移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去

6、部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。病毒载体大体上可分为两种类型：收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中，将外源基因表达盒（exogenousgeneex

7、pressioncassette）插入穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，与辅助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞，通过细胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（GrahamFLandPrevecL1995）。无病毒基因的病毒载体（gutlessvectors）：这类载体在不同的病毒载体系统中的称谓不同。对于腺病毒，一般称为mini-Ad；在HSV载体系统，一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体。重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体。这类载体系统往往由载体质粒和辅助

8、系统组成。重组载体质粒主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成。辅助系统包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。在辅助系统的作用下，重组载体质粒（包含或不包含