高级生化7-电泳技术课件.ppt

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1、蛋白质分离分析方法之四：——电泳技术2010.1011.定义：——带电离子在电场中的移动称为电泳。在外电场的作用下，带电蛋白质颗粒将向旨与其电性相反的电极移动。电泳技术是分离不同分子混合物的常用实验技术。可用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。22.影响蛋白质的泳动速度的因素：内不因素——主要决定于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。外界因素——如溶液的pH值、离子强度、电场强度、温度等也会影响蛋白颗粒的泳动速度。不同蛋白质的等电点分子大小和形状不同，在同一pH时带电荷数不等，因而其在

2、同一电泳条件下的泳动速度不同因而可被分开。34若将带静电荷Q的离子置于电场中，它的受力简单分析如下：电荷引力：F引＝EQ根据Stokes公式，运动中的颗粒在溶液中受到阻力：F阻＝6πrην平衡时，有F引＝F阻，即EQ＝6πrην整理后得：ν＝EQ/（6πrη）式中：E——电场强度；r——球形粒子的半径；η——溶液的粘度系数；ν——带电粒子运动速度。53。电泳分类按照电泳时是否使用支持介质，可将电泳分为界面电泳区带电泳。63.1自由电泳在溶液中进行方法是先在U-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面，然后加

3、一电场(图)，界面就会移动，每个移动界面(峰)相当于某一特定的蛋白质。由于界面处存在浓度梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面(电泳照相谱中的峰)的移动，吸收峰的面积代表了蛋白质的含量。73.2区带电泳——在固体支持物上进行按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为:滤纸电泳－在滤纸电泳；薄膜电泳－如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳；粉末电泳－支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和铺设成平板；细丝电泳－如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是—类微量电泳；凝胶电泳—如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝

4、胶等8按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式；2)垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳；3)垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类；4)连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。后来有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸来分离血清蛋白质，分离量最大。9凝胶电泳－最常用的介质有：（1）聚丙烯酰胺凝胶（分离蛋白质）（2）琼脂糖凝胶（分离核酸）。这两种凝胶电泳的分辨率都很高。另有：琼脂、硅胶、

5、淀粉胶等10聚丙烯酰胺凝胶是分离蛋白质时最常用的凝胶，可以制作成平板或柱子（图）。故又称为平板凝胶电泳和柱状凝胶。1112dodecylsulfatepolyacylamidegelelectrophoresis①SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。②SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。134.电泳技术的应用：电泳技术主要用于分离各种有机物（

6、如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。14纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史，在实验室和临床检验中都曾经广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来，纸电泳

7、已被醋酸纤维薄膜电泳所取代。因为后者具有比纸电泳电渗小、分离速率快、分离清晰、血清用量少以及操作简单等优点。4.1纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳15琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖。由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少，电渗影响减弱，因而使分离效果显著提高。例如血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带（α-脂蛋白、β-脂蛋白），而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带（α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白）。所以琼脂糖为较理想的凝胶电泳的一种材料。血清中的脂类物质与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白形式存在，各种脂蛋白

8、中所含的载脂蛋白种类和数量不同、脂蛋白颗粒大小不同等因素，使它们在电场中的移动速率各异，因而可以通过电泳达到分离。4.2琼脂糖凝胶电泳：16琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的