蛋白质--高级生化课件.ppt

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1、蛋白质高级生物化学姓名1CONTENTS01·蛋白质的分离与纯化02·蛋白质分子量的测定03·蛋白质含量的测定201蛋白质的分离与纯化1、根据蛋白质溶解度不同进行分离：盐析法、等电点沉淀、低温有机溶剂沉淀法2、根据蛋白质分子大小进行分离：透析与超滤、凝胶过滤法3、根据带电性质进行分离：电泳法、离子交换层析法4、根据配体特异性进行分离：亲和层析法301蛋白质的分离与纯化利用蛋白质理化性质的差异，可以对蛋白质进行分离纯化。由于蛋白质容易变性，选择的方法要尽可能温和，通过多种分离方法的合理搭配，才有可能得到回收率和纯度较高的纯化蛋白质。4011

2、、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离与纯化1.1盐析法：在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。加入中性盐低盐----盐溶高盐----盐析基本原理正常条件下，蛋白质呈稳定的分散状态蛋白质为两性物质，表面电荷的静电斥力作用分子表面的水化膜5011、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离与纯化1.1盐析法无机盐的选择（NH4）2SO4,MgSO4,Na2SO4,NaCl,Na3PO4等，最常用的是（NH4）2SO4廉价在水中溶解度大，而且溶解度随温度变化小，低温下也能盐析对大多数蛋白质的活力无损害601

3、1、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离与纯化1.1盐析法盐析后处理盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去。常用透析法：把蛋白质溶液放入透析袋内（常用玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断更换缓冲液。在低温下进行。也可用葡聚糖凝胶柱层析的办法。7011、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离与纯化1.2等电点沉淀蛋白质在等电点状态时净电荷为零，颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小。可调节溶液的pH值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。此法很少单独使用，可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用。8011、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离

4、与纯化1.3低温有机溶剂沉淀法在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂后，具有相反电性的离子基团之间的吸引力增加，这就促使它们互相聚集，并沉淀出来。近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。9011、根据蛋白质溶解度不同进行分离蛋白质的分离与纯化1.3低温有机溶剂沉淀法常用的有机溶剂有乙醇或丙酮。如果同时将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，沉淀效率较高，但蛋白质较容易变性，只用于分离某些较稳定的蛋白质。为了防止蛋白质变性，

5、应在低温下沉淀。10012、根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的分离与纯化2.1透析与超滤透析法是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖和氨基酸等分开。超滤法是利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子质量的蛋白质。11012、根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的分离与纯化12012、根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的分离与纯化2.2凝胶过滤法（分子排阻层析或分子筛层析）根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。利用有一定孔径的多孔的亲水性

6、凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。13012、根据蛋白质分子大小进行分离蛋白质的分离与纯化14013、根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的分离与纯化3.1电泳法现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异

7、高分辨率地分离或分析蛋白质。在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。15013、根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质的分离与纯化3.2离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。16013、根据蛋白质带电性质进行分离蛋

8、白质的分离与纯化17014、根据配体特异性进行分离蛋白质的分离与纯化4.1亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，具有高度的专一性，通常只需经过一步处理，即可将待提纯的蛋白质从很复杂的混合