高级生化-蛋白质生物大分子

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1、高级生化-蛋白质生物大分子蛋白质生物大分子一、蛋白质在机体内的生物学功能???????????生物催化作用：酶运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白调节作用：如胰岛素、生长激素(调节基因表达和代谢调节)运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白能量转换蛋白：如细胞色素基因调节蛋白：如阻遏蛋白转运功能：储存功能：二、蛋白质的定量分析方法（确定蛋白质是否存在何种蛋白质，可以基于蛋白质元素组成特点、蛋白质的化学显示反应、蛋白质的光吸收特性三类方法测））?

2、茚三酮反应：a氨基和a羧基共同参与的反应。?双缩脲反应(Biuret法)：肽和蛋白质所特有而氨基酸没有的颜色反应。（多肽与双缩脲反应生成紫蓝色络合物）?Folin-酚法—改良Lowry法：最常用,精确度高（络氨酸和色氨酸酚基与还原酚试剂起蓝色反应，改良法是在标本中先加碱性铜试剂，提高灵敏度）?Bradford法：主要成分为考马斯亮蓝G250：这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。（考马斯亮蓝与蛋白质的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合，使染料吸收峰改变）?紫外/可见光谱：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280

3、nm附近。三、蛋白质的定性检测?SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白相对分子量（迁移率与分子量呈对数线性关系）?利用免疫技术研究蛋白质的表达水平或在细胞中的定位（如流式细胞仪和免疫组化等方法）?用Westernbloting检测蛋白表达差异?利用外源基因的转移和表达技术研究蛋白质功能（细胞转染技术）?利用基因封闭技术研究蛋白质功能，致使它们编码的蛋白质不能表达,然后观察生物体的生理学行为和指标,最终确认此基因和其表达产物的重要性。（基因敲除/低）四、基因敲除技术（geneknockout）：是通过一定的途径使机体特

4、定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。然后从整体观察实验动物，观察缺失该蛋白的个体出现的表型变化,然后再推测蛋白在体内的可能功能.基因敲除的技术路线如下：（1）把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因载体上﹔（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。（3）用选择培养

5、基筛选已击中的细胞﹔（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。五、RNA干扰（RNAi：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。RNA干扰的生物学意义?????阻抑不必要或有害基因表达，对细胞及机体正常功能的发挥和维持至关重要.

6、保护基因组免受外源核酸侵入.抑制转基因表达.抵抗病毒感染.基因表达调控RNA干扰的应用前景1、探索基因功能的有力工具2、基因敲除3、用于基因治疗4、新药物的研究与开发六、Dicer酶：dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNAspecificendonuclease，DICER）RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，将RNA降解为19—21bp的双链RNAs(siRNAs)。七、反义RNA(antisenseRNA)：

7、是指与mRNA互补的RNA分子,也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。八、蛋白质空间结构分析：圆二色性(circulardichroism,CD)：由于包含发色团的分子的不对称性，而引起左右(R,L)两圆偏振光具有不同的光吸收的现象。常用于研究溶液中蛋白质的二级结构，是一种测定分子不对称结构的光谱法。晶体X衍射技术(X-raydiffractionbycrystals)：X射线在晶体中发生的衍射现象。晶体具有点阵结构，

8、X射线衍射现象是一种基于波叠加原理的干涉现象，X射线通过晶体之后，在某些方向（衍射方向）X射线的强度增强，而另一些方向X射线强度却减弱甚至消失，如果在晶体的背后放臵一张感光底片，将会得到X射线的衍射图形。x-射线晶体衍射是测定蛋白质分子空间构型的主要方法，也是确定蛋白质构象最准确的方法。九、蛋白质的相互作用：酵母双杂交系统：将酵母作为分析蛋白质-蛋白质相互作