无菌检查方法学验证实验08年11月课件.ppt

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1、无菌检查法及《中国药典》2005年版无菌检查法中方法验证试验2005版《中国药典》张春华一·无菌检查法1.基本定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。2·需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围各种注射剂眼用及外伤用制剂植入剂可吸收的止血剂外用敷料、器材3·环境要求及无菌操作环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域一般要求18～26℃45％～65％例行消毒处理洁净度检查阳性实验室、检查间分

2、离。无菌操作防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；有效避免操作者自身被微生物感染。无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室。4·仪器及设备无菌室内常备器具恒温培养箱、生化培养箱离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等玻璃器皿无菌衣，裤，帽，口罩除菌滤器及滤膜其他用具：手术剪、镊、接种环、酒精灯、微波炉、电子天平、洗耳球、纱布、牛皮纸、棉线绳等。洁净间的日常监测浮游菌沉降菌5·培养基、稀释液及冲洗液

3、硫乙醇酸盐培养基属于流体培养基，即在液体培养基中加入0.05%～0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中的含氧量，使培养基在一段时间内保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生长。硫乙醇酸盐培养基有红色的氧化层，适合需气菌的生长，在供试品接种前，培养基的氧化层的颜色不得超过培养基深度的1／5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基是固体培养基，在液体培养基中添加1%～2%的琼脂作为凝固剂。45℃以上时为液态培养基，使用时需在水浴中保存。营养肉

4、汤培养基、改良马丁培养基。表面活性剂，中和剂。一般采用商品脱水培养基洁净玻璃器皿纯水培养基的pH应符合规定分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理培养基的储存:2～25℃、避光环境，可保存三周左右稀释剂1.0.9%氯化钠溶液：常用的等渗溶液。2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌测定。3.0.1%蛋白胨水溶液。培养基的装量培养基的适用性检查培养基的无菌性检查培养基的灵敏度检查培养基的灵敏度检查取每管装量不少于12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9

5、支，分别接种小于100cfu的黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各2支。另1支不接种作为空白对照，培养3天；每管装量不少于9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。6·试验用菌株及菌液制备菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[

6、CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。《中国药典》2005年无菌检查和微生物限度检查的验证试验中使用7株菌见表1：表17株菌的培养条件菌种接种培养基培养温度℃培养时间金黄色葡萄球菌30～3518～24h铜绿假单孢菌营养肉汤或者普通枯草芽孢杆菌斜面大肠埃希菌生孢梭菌硫乙醇酸盐培

7、养基白色念珠菌改良马丁或者普通23～2824～48h斜面黑曲霉改良马丁斜面23～285～7d金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。生孢梭菌菌液的制备接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，采

8、用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。菌数测定用硫乙醇酸盐流体培养基试管法。白色念珠菌菌液的制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基,23～28℃培养24～48小时，上述培养物采用液