无菌检查方法学验证实验08年5月

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1、无菌检查法及《中国药典》2005年版无菌检查法中方法验证试验2005版《中国药典》张春华一·无菌检查法1.基本定义无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。2·需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围各种注射剂眼用及外伤用制剂植入剂可吸收的止血剂外用敷料、器材3·环境要求环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域一般要求18～26℃45％～65％例行消毒处理洁净度检查4·仪器及用具无菌室内常备器具恒温培养箱及生化培养

2、箱离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等玻璃器皿无菌衣，裤，帽，口罩除菌滤器及滤膜5·培养基一般采用商品脱水培养基洁净玻璃器皿纯水培养基的pH应符合规定分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理培养基的储存:2～25℃、避光环境，可保存三周左右培养基的装量培养基的适用性检查培养基的无菌性检查培养基的灵敏度检查培养基的灵敏度检查硫乙12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另

3、1支培养基空白对照。培养5d。结果判定空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。（原3支管有2管生长，合格。）6·菌种及菌液制备菌种的保藏和传代甘油冷冻管保藏法斜面低温保藏法菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusnig

4、er)[CMCC(F)98003]菌液制备一般当日使用金葡·铜绿的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，20～25℃培养5～7d检验方法必须验证薄膜过滤法验证试验直接接种法验证试验判断二·方法验证试验1.薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。2.直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求

5、的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用

6、增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。3.阳性对照应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。3.1.阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌），如菌量为小于100cfu，供试

7、品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量（见药典附录表2、表3）。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。3.2.阴性对照每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。(二)检查法有直接接种法和薄膜过滤法。1.薄膜过滤法强调了要“优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。”无菌检查用的滤膜孔径为0.45µm与直径为50mm。根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供

8、试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。过滤时，