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1、凝胶过滤层析技术content凝胶过滤的基本原理凝胶分类与性质凝胶过滤的基本操作凝胶过滤层析的应用凝胶过滤层析技术Services凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶层析或排阻层析,是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象“筛子”,不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
2、基本原理原理分子洗脱体积分配系数Services
3、基本原理凝胶过滤层析过程示意图原理分子洗脱体积分配系数Services
4、基本原
5、理我们将要分离的分子分为三类原理洗脱体积分配系数分子原理Services
6、基本原理1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。（用Vo表示）2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi）3、基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（用Vg表示）4、柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（用Vt表示）5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（用Ve表示）Vt=Vo+Vi+Vg分配系数原理洗脱体积分子分子Services
7、基本原理最先流出物质A
8、，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其洗脱体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，“全渗入”。洗脱体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻”或“部分渗入”。洗脱体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi分配系数原理洗脱体积分子分子分子洗脱体积原理Services分配系数
9、基本原理当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。
10、当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。分配系数Kd分配系数是指某个组分在固定相中和流动相中的浓度比，对于凝胶过滤，分配系数表示组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系Kd=对于某一型号的凝胶，在一定分子范围内，各个组分的Kd与其分子量对数呈线性关系测定分子量凝胶含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，一般制成球状颗粒。
11、分类与性质性能多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好凝胶分类性质凝胶凝胶分类性质
12、分类与性质葡聚糖凝胶(Sephadex
13、)结构稳定性色谱性
14、分类与性质聚丙烯酰胺(Bio-Gelp-x)凝胶凝胶分类性质结构稳定性色谱性
15、分类与性质交联丙烯基葡萄糖(Sephacryl)凝胶凝胶分类性质结构稳定性色谱性
16、分类与性质琼脂糖凝胶(Sepharose)结构制备色谱性产品名因生产厂家不同而异稳定性凝胶凝胶分类性质
17、分类与性质交联琼脂糖(Sepharose)凝胶凝胶分类性质结构稳定性色谱性
18、分类与性质新型凝胶superosesuperdex凝胶凝胶分类性质
19、基本操作凝胶的选择凝胶的处理选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种
20、凝胶及其型号、粒度。凝胶的性质分离目的和样品的性质对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式类分离——将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类分级分离——将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白后者对实验条件和操作要求都比较高（1）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的Kd=1。（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。（2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。（3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱
21、流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。干凝胶加入5、10倍的蒸馏水→充分浸泡→去小颗粒→用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液浸泡0.5h→去碱液→蒸馏水洗至中性除去凝胶中的气泡的方法抽气加热煮沸注意点:避免置于酸或碱溶液中加热凝胶层析柱加样洗脱再生保存
22、基本操作柱的选择柱的装填同样直径的层析柱长层析柱比短的分辨率高；同样长度的层析柱直径大的比小的分辨率高；同样体积的层析柱层析柱长的比短的分辨率高。理想的层析柱直径与长度之比是1：25-1：100常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻
23、璃珠、垂熔玻璃等。空柱中应留约1/5的水或溶剂。不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。凝胶加样洗脱再生保存层析柱凝胶
24、基本操作加样洗脱液蛋白质类样品浓度:不大于4%。加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。洗脱速度由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一
