《凝胶过滤色谱填料》ppt课件

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1、凝胶过滤色谱填料第三组概述凝胶过滤色谱分离原理凝胶过滤色谱填料的种类和性能凝胶色谱填料的制备常见凝胶过滤色谱填料目录凝胶过滤色谱的应用概述凝胶过滤色谱是体积排除色谱（SEC）的一种。溶质只依据其分子体积（流体力学体积）的大小而分离。体积排除色谱（SEC）与其他色谱相比较的优点：①出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi和V0之间，且不需要梯度淋洗。②溶质与固定相（填料）和流动相之间没有相互作用。③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上，故柱寿命长。与其他色谱相比较的优点：④可用于测定生物大分子的分子量⑤生物相容性好，有很高

2、的活性回收率⑥负载量较大，利于制备分离。主要缺点：分辨率及峰容量均相对较低。凝胶过滤色谱的分离原理◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱中进。◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中，即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。②分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔；如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的孔体积。这样，分子体积不同的混合物一起进入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分子先流出

3、柱子，小分子量即体积小的分子印刻进入凝胶的孔中，使其行程延长而滞后流出，从而使分子体积不同的分子得以分离。凝胶过滤色谱填料的种类和性能用于凝胶色谱的填料主要是用天然的多糖类原料制成的，它们的机械强度低，粒径较大而不均匀，很难在高流速下流动，费时、费力且分辨率也很低。早期理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能：1.机械强度高，能耐受几兆帕的操作压力。2.球形颗粒，粒子直径控制在3~10um，且粒径分布窄，达到高柱效。3.具有亲水性表面，以利降低疏水性效应。4.非离子性，表面没有离子交换基团。5.孔径约为5~100nm

4、之间，以适应不同分子量范围物质的分离只需。6.具有较高的孔径，以利于得到高分容量。7.较高的化学稳定性，有较宽的适用PH值范围.8.有较好的生物相容性，不会引起生物活性物质的失活和降解。9.容易处理和充填。10.价格合理。以可控孔径玻璃（CPG）、硅胶为基质的无机基质高效凝胶色谱填料和以合成高分子或高交联天然高分子为基质的有机高效凝胶色谱填料相继问世，他们均基本上可以满足上述要求。20世纪70年代中期！！！填料基本参数孔径或孔径分布粒度及粒度分布孔容粒径及粒径分影响其柱效例如，通常所使用的直径5um的软胶，能达到

5、理论塔板数1500/m左右的柱效关系到凝胶色谱柱的分离容量。根据凝胶色谱柱的一般理论，孔容愈大，所填装的柱子的分辨率和柱子的容量就愈高。因此，用作凝胶分离介质的硅胶，必须具有较高的孔容。因此，用作凝胶分离介质的硅胶，必须具有较高的孔度。对于多空硅胶而言，Ψ一般在0.6~0.7，故Vi/V0值应在1.05~1.23之间指的是可用于分离的样品的最大分子量。一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形，而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此工作曲线会带来很大

6、的误差。故最好以蛋白质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作曲线。凝胶过滤色谱的渗透极限：由工作曲线可确定该凝胶过滤色谱柱的分离范围，指的是工作曲线线性部分所对应的分子量区间。！因此：！凝胶色谱填料的制备未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带上亲水性基团。制备方法如下：见书246即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化

7、试剂，以高孔隙度硅胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型化学键合硅胶。常见凝胶过滤色谱填料表11-8列出了常见的无机型亲水凝胶，尽管牌号各异，但其化学本质几乎均是二醇型化学键合硅胶。！见书本247页凝胶过滤色谱的应用例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解液，水解液经SephadexG-25凝胶过滤色谱进行分子量分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定法（FRAP

8、）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC分离和氨基酸组成分析凝胶过滤色谱的应用例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase的凝胶过滤色谱复性方法:使用透析和凝胶色谱对Fibrolase复性进行研究,比较2种复性方法的相对复性率及蛋白质回收率。结果:2种复性方法的复性率分别为20%、25