蛋白质分离纯化与鉴定―综合性实验课件.ppt

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1、蛋白质分离纯化与鉴定—综合性实验三峡大学医学院生物化学教研室1、从血清获得高纯度的白蛋白2、掌握蛋白质盐析、G-25葡聚糖凝胶层析脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析、SDS-PAGE电泳的原理与实验操作技术3、掌握考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和操作方法4、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法实验目的实验流程蛋白质盐析葡聚糖凝胶Ｇ-25（脱盐）DEAE-Cellulose离子交换（纯化）蛋白质浓度检测SDS-PAGE电泳法（鉴定蛋白质纯度）柱层析实验装置UVmonitorRecorderFractionCollectorColumnBuff

2、erReservoir柱层析实验仪器一：HD-3紫外检测仪波长光量灵敏度电源调零根据光吸收原理设计，光源为紫外光，可监测具有紫外吸收物质(蛋白质、核酸、多肽、酶)的检测仪器，与层析柱、部份收集器及记录仪配套，组成一个完整的液相色谱分离分析装置。构造和功能1.检查：连接是否正确，将“波长”旋钮旋到所需波长刻度；2.预热：按下“电源”开关，电源指示灯亮；3.调100%：把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量”旋钮，数字显示为100，即透光率为100％；4.调零：把“灵敏度”旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调节“调零”旋钮，数字显示为“0”。备注：以上步骤需反复调节几次。在样品

3、检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。使用方法柱层析实验仪器二：BSZ-100自动部份收集器构造和功能选择置数手/自动切换复位按照设定的时间自动收集样品使用方法1.准备：检查“漏液报警板”、试管插在收集架上；2.定位：按“复位”键，“报警”后，再按“复位”键，仪器自动复位；把安全阀上横杆一头的硅胶管对准第一根试管位置，固定好螺钉；3.定时：按“手动/自动”键，仪器为[手动]状态，按“选择”键选定位置，按“置数”键设置时间，再按“选择”键确定；4.自动收集：按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器为[收集]状态；按

4、“手动/自动”键，仪器为[自动收集]状态；5.停止收集：或按“手/自动”键，仪器为[手动]状态或关电源。柱层析实验仪器三：LM17型记录仪构造和功能抬/落笔手柄量程显示调纸速纸速启停纸速显示电源量程/零位切换键当样品流过检测仪时，记录仪即可绘出洗脱图谱使用方法1.打开：按“电源”；2.调零：按“量程/零位”键，零位指示灯亮，数码管显示“Po”，按[左移]或[右移]键，使记录笔移至所需零位；3.选择量程：按“量程/零位”键，量程指示灯亮，数码管显示当前量程范围，按[增加]或[减少]键，使量程为10mV；4.调纸速：按“启/停”键，“纸速显示”闪烁，按“调速”键调节纸速，确定后按“启/停

5、”键；5.记录：取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”；实验原理一：盐析盐析saltingout高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性，从而将蛋白质从溶液中析出。常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等+++++++水化膜实验操作一：盐析0.5mlSerum0.5mls(NH4)2SO4Mix5000rpm/10minSupernatantPrecipitate上清转至另一Ep管备用；沉淀＋0.5mldH2O，离心，留上清液备用。(白蛋白和球蛋白分别留200ul用于电泳上样)实验原理二：凝胶层析Sephadexstructure(L

6、eft:molecule;Right:model)凝胶过滤gelfiltrationTable.PhysicalCharacteristicsofPolydextranGelsDesignationSephadexG10SephadexG25SephadexG50FractionationRange(MW)7001,000-5,0001,500-30,000DesignationSephadexG100SephadexG150SephadexG200FractionationRange(MW)4,000-150,0005,000-400,0005,000-800,000实验操作二：G

7、-25葡聚糖凝胶层析脱盐1.平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡G-25柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定;2.上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面;3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次;4.收集:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，同时开启自动部分收集器进行收集；5.再次平衡:继续用0.02mol/LNH4Ac流洗直到记录仪基线恢复到零。实验原理