生物化学 蛋白质分离纯化与鉴定ppt课件.ppt

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1、蛋白质分离纯化与鉴定一、蛋白质的分离、纯化鉴定的一般原则增加制品纯度或比活力除去变形的蛋白质和其他杂蛋白蛋白质的产量达到最高值蛋白质分离纯化的一般原则：1.前处理：因动/植物/细菌而异目的蛋白在细胞内动物：匀浆器、组织捣碎机、超声波和丙酮干粉等。植物：石英砂研磨或纤维素酶处理等。微生物：超声振荡、研磨、溶菌酶和细胞自溶等。目的蛋白在细胞组分中，可用差速离心等方法。2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶二、混合蛋白质的分离、纯化方法根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀技术根据蛋白

2、质分子大小的差异分离根据蛋白质的荷电差异分离根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析蛋白质的分离方法1、以溶解度为基础的方法（1）等电点沉淀不同的蛋白在各自pI处依次沉淀（2）盐溶和盐析（3）有机溶剂分级分离降低介电常数争夺水化膜2、以分子大小为依据的方法（1）凝胶层析（2）透析（3）超滤（4）离心凝胶层析原理：1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网

3、状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）透析——只用于除盐类和小分子杂质透析——只用于除盐类和小分子杂质超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液密度梯度离心滴加样品4%8%12%16%20%塑料离心管蔗糖密度梯度

4、（介质还可用：氯化铯、甘油等）蔗糖浓度%分子量由小—————大3、以蛋白质电荷为依据的方法（1）电泳（2）离子交换层析电泳法类型：1、区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取

5、决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳导致：1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质比，并具有相似的构象，

6、因而有如下公式：lgM=K1—K2μR（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其μR作图，根据样品的μR值，从标准曲线上就可查出其分子量。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦（Isoelectricfocusing）(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)载体两性电解质：a是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。b混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证

7、能顺序排列；c混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；d要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。等电聚焦（Isoelectricfocusing）通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。注意事项：1、时间相对长对分离有利；2、也可用来测定蛋白质的等电点。等电聚焦（Isoele