免疫组化课件.ppt

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1、免疫组织化学技术(immunohistochemistry)一、定义及其发展：免疫组织/细胞化学(immunohisyo/cyto-chemisty)是组织化学技术的分支，它是用已知并标记的特异性抗体（抗原）对组织（细胞）内的抗原（抗体）的存在及分布进行组织原位的定性或定量显示。原位免疫学(insituimmunology)其特点：高度特异性高度敏感性方法和过程统一形态、机能、新陈代谢等生命活动相结合。因此免疫组织（细胞）化学技术已被广泛用于生命科学的研究。Coons及同事们于1941年首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌获得成功，开

2、创了组织化学中免疫组织化学技术的新篇章。Nakane1968建立酶标抗体（抗原）技术。Stermerger1979在此基础上改良并建立了HRP抗HRP方法（PAP）技术，使免疫组织化学得到日益的发展和运用。Hsu等1981年建立卵白素—生物素—HRP复合物法（ABC法）。此后：免疫金—银染色方法半抗原标记法免疫电镜技术等相继问世这些方法目前已成科学研究中的一项有力工具。免疫组织细胞化学技术的全过程包括：1.抗原提取和纯化：2.免疫动物：3.抗体的分离、提取、纯化和效价的确定：4.标记抗体：5.标本制备：6.免疫反应过程：7.观察及结

3、果判断与分析：二、有关免疫学的基本知识（一）抗原（antigen,Ag）1.抗原的定义：2.抗原的性质：①异种异体物质②大分子胶体③抗原的特异性3.种类：全抗原不全抗原/半抗原(二)抗体（antibody,Ab）1.定义：2.性质：（1）一般性：（2）抗原性：3.抗体的种类：免疫抗体：天然抗体：自身抗体：（三）抗原与抗体的反应抗原与抗体的结合是高度特异性的结合。一个抗体分子有两个抗原结合点，称为两价。有多个结合点称为多价。抗原与抗体反应不受两者数量比例限制，但如果需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量要保持一定的比例。3.主要的血

4、清学反应有三种类型：凝集反应：沉淀反应：有补体参加的各种血清反应：（四）抗体形成的机理1.免疫反应的形成：可分三个阶段：（1）致敏阶段：（2）反应阶段：（3）效应阶段：2.影响抗体产生的因素（1）抗原的质和量（2）机体方面①免疫途径②免疫次数及间隔③机体处于发育的不同阶段、免疫细胞对抗原刺激的反应不同。（五）抗体的来源1.市售抗体：2.自制抗体：（1）制备过程：①抗体分离、提取与纯化。②用抗原免疫动物。常用动物：兔③抗体的分离、提取与纯化，兔抗—一抗④一抗作为抗原再免疫动物。常用动物：羊。⑤羊抗兔抗体的分离、提取与纯化（羊抗兔）—二

5、抗。（2）抗体的标记：常用的标记物有：a.荧光素：荧光抗体：异硫氰酸荧光素（FLTC）：四乙基罗达明（RB200）：四甲基异硫氰酸罗达明（TMRITC）：b.酶：酶标抗体：前面介绍的四种酶均用于标记抗体，但常用的是—辣根过氧化物酶(HRP)。c.抗生物素—生物素—HRP：生物素与二抗结合—生物素标记二抗，生物素与HRP结合—生物素标记HRP。使用前：生物素标记HRP+抗生物素→→形成抗生物素—生物素—HRP—复合物—→→ABC复合法d.金属：常用的金属有金、银、铁。一般光镜下不用，作免疫电镜时，才使用金属标记，金属致密，在电镜下离子

6、密度高，便于区别。金：用溶胶状态的金—胶体金。最常用。银：很少用。铁：一般不能直接用于标记抗体。常用铁蛋白，建立免疫铁蛋白技术。（六）抗体的配制1.抗体分装贮存：2.抗体使用液的配制：（1）抗体最佳稀释度的测定方法：（2）方阵测定法：（3）抗体稀释液的配制：常用0.01mol/LPH=7.4PBS/TBS(Tris缓冲生理盐水)缓冲液作稀释液。（七）免疫染色/免疫反应：抗原一抗体反应：一般程序是：①标记抗体与标本中的抗原结合。②PBS冲洗未结合的抗体。③直接观察或显色后观察结果。减少非特性染色的方法有：1.增强特异染色的方法：①蛋白

7、酶消化法：②合适的抗体稀释液：a.抗体效价的高低。b.温育时间的长短。c.抗体的纯度。d.稀释液的种类、标本制作等方面。③温育的时间长短30~60℃　4℃过液。④多层染色，提高敏感度。2.减少或消除非特异性染色：3.显色反应的控制：3.复染：（八）对照主要是针对第一抗体对照。1.阳性对照：2.阴性对照：3.假阳性对照：4.假阴性对照：三、常见的免疫组织化学方法免疫反应的基本步骤：1.处理切片，封闭内源性物质和避免交差反应。2.1抗孵育切片，湿室，37℃，30~60分钟。3.PBS漂洗，3次×5分钟。4.2抗孵育切片，湿室，室温，30

8、~60分钟。5.PBS漂洗，3次×5分钟。6.呈色：0.01~0.1%H2O2+0.01~0.05%DAB+0.05~0.01mol/Ltris-HCl(PH7.4)。室温，3~5分钟，避光。7.漂洗。8.复染。9.漂洗。10.脱水、