免疫组化9教学ppt课件

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1、免疫组化技术杨林高云娟药理学专业基本原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。一、组织与细胞材料的制备细胞：细胞涂片和细胞爬片组织：石蜡切片和冰冻切片组织切片的制作1、组织的固定2、组织石蜡包埋3、切片组织切片机固定的目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转

2、变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。固定液的选择固定的时间通常所用的固定液：1、甲醛固定液（10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中性缓冲福尔马林）2、PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。3、Meth

3、acarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。固定时间的长短要根据组织块的厚度，固定液的种类以及浓度，温度而定，一般而言，厚度越后，固定时间越长组织石蜡包埋组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。切片石蜡切片：1、连续切片按序贴在玻片的下1/3。2、52－60℃烤片18h。3、切片厚2～4μm。4、切片

4、可在4℃保存数年冰冻切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用1、将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。2、待细胞生长达到60％以上后取出玻片。3、用4%的多聚甲醛固定2h以上。4、可加甘油封存置于零下20度保存。细胞爬片细胞培养六孔板细胞涂片1、离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。2、吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。3、待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时

5、。4、在细胞上加一层甘油放-20℃保存二、免疫组化被检测物质组织或者是细胞中凡是能作为抗原或是半抗原的物质，如如蛋白质、多糖、磷脂、受体、酶、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。所用抗体一般为单克隆抗体或者是多克隆抗体被检测抗原的修复指石蜡，冰冻，火棉胶，塑料切片免疫组织化学前用胰蛋白酶，尿素，表面活性剂等通过机械的方式断开福尔马林固定导致的抗原表位和不相关的蛋白的交联键，从而使得掩盖的抗原决定簇或者变性的抗原重新暴露，使抗体更好的渗透，与表位相结合。抗原修复的方法加热修复非加热修复微波抗原修复法高压锅抗原修复法水浴高湿抗原修复法酶消化法酸水解法真空负压

6、法等。①切片脱蜡至水。②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。目的是破坏细胞内的过氧化氢酶③自来水洗，蒸馏水洗。④PBS洗3次，1分钟/次。⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。⑥PBS洗3次，2分钟/次。⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。胰蛋白酶消化法免疫组化按照标记物质的种类：免疫荧光法，放射免疫法，免疫酶标法按照染色步骤：直接法和间接法，间接法较直接法灵敏度高按结合方式：抗原-抗体结合如PAP法，亲和连接法-ABC法和SP法等，聚合物连接法适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测直接法间接法荧光标记免疫组化二步法免疫组化染色步骤1

7、、二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯。2、PBS冲洗3次，每次3分钟。3、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。4、0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。5、PBS冲洗、浸泡5分钟，3次。6、正常山羊血清室温封闭10分钟。7、甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜8、PBS冲洗，浸泡5分钟，3次9、滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次10、新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗11、苏木素复染，脱水，透明，封片。12、显微镜观察拍照13、IPP软件分析光密度注意事项一、抗体

8、的保存1、