植物叶绿体色素含量的测定课件.ppt

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1、植物叶绿体色素含量的测定福建农林大学生命科学学院植物生理生化实验室高等植物叶绿体色素叶绿素类胡萝卜叶黄素---C40H56O胡萝卜素---C40H56叶绿素b---C55H70O6N4Mg叶绿素a---C55H72O5N4Mg叶绿素吸收光谱：最大吸收区域在蓝紫光部分（400-500nm），基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。类胡萝卜素吸收光谱：红光区蓝光区叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离的情况下同时测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度，可分别测定在663nm、645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）和475nm的光吸收，然后根据La

2、mbert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）将上式整理，可以得到下式：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649–7.32A665CT=Ca+Cb=18.08A649-6.63A665CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245叶绿体色素，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。同时，叶绿体色素在植物细胞内是以色素蛋白复合体的结构存在的。故通常用80%的丙酮或95%乙醇提取叶绿素。叶绿体色素的提取为什么要用含有水的有机溶剂提

3、取叶片中的叶绿素？这是因为叶绿素分子结构的“头部”是亲水的，与蛋白质结合很牢，需要经过水溶解作用才可被提取出来。实验步骤1．取2种新鲜玉米（完全/缺素）叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2．各称取0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2ml95％乙醇，研成匀浆，再加少量95%乙醇，多次研磨至组织发白，静置片刻。加入少量碳酸钙；弱光下研磨，速度要快实验步骤3．取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵和研棒数次，将液体全部倒入漏斗中。4．用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶

4、中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至25ml，摇匀。残渣中的色素要充分洗脱！实验步骤5．把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。完全缺素A470A649A665过滤的比色液不能混浊95%乙醇提取液中色素计算公式：①Ca=13.95A665-6.88A649②Cb=24.96A649–7.32A665CT=Ca+Cb=18.08A649-6.63A665③CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245以上是求出叶绿素总浓度，mg.L-1按以下公式计算各色素含量(mg.g鲜重-1

5、)：叶绿体色素含量=色素的浓度×提取液体积(L)×稀释倍数样品鲜重(g)注意事项：1、研磨要在弱光下进行，且速度要快；2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素；3、残渣中的色素要充分洗脱；4、波长要调准；5、比色液不能混浊。思考题1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定量分析？为什么？2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无水丙酮或乙醇提取？