叶绿体色素的提取及含量测定ppt课件.ppt

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1、实验5叶绿体色素的提取与含量测定一、目的掌握叶绿体色素的提取方法与含量测定方法1二、原理1、提取原理：叶绿体色素是酯类化合物均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水的混合液提取。叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。新鲜的叶片可用无水丙酮提取。叶干粉用85％丙酮提取。22、测定原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：D=kCL（1）式

2、中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。3如果溶液中有几种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的消光度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。4已知

3、叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，根据加和性原则列出以下关系式：D663=82.04Ca+9.27Cb（2）D645=16.75Ca+45.60Cb（3）式中：D663和D645：叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的消光度；Ca和Cb：叶绿素a和b的浓度mg/L。解方程组（2）和（3）得：Ca=12.72D663–2.59D645（4）Cb=22.88D645–4.67D663（5）将

4、Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT：CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663（6）5另外，由于叶绿素a、b在652mn的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a、b总量：CT=（D652×1000）／34.5（7）在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80％丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：Ca=12.21D663–2.81D646（8）Cb=20.13D646–5.03D663（9）Cx=

5、（1000D470–3.27Ca–104Cb）／229（10）式中：Ca、Cb—叶绿素a和b的浓度。Cx—类胡萝卜素的总浓度。D663、D646和D470—叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的消光度。6由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：Ca=13.95D665–6.88D649（11）Cb=24.96D649–7.32D665（12）Cx=（1000D470–2.05

6、Ca–114Cb）/245（13）7二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。（二）试剂95％乙醇（或80％丙酮）。石英砂。碳酸钙粉。（三）仪器设备分光光度计，研钵1套，剪刀1把，玻棒，25mL棕色容量瓶3个，小漏斗3个，直径7cm定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（0.01g感量）。8三、实验步骤1.取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2.称取剪碎的新鲜样品0.5g，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及5ml丙酮，研成匀浆，再加80∮丙酮5mL，继续研磨至组织变白，静止3～5min。3.取滤纸1张，置

7、漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25mL，摇匀。95.把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665、649和470nm下测定消光度。6.按公式17–11、17–12、17–13（如用80％丙酮，则按公式17–8、17–9、17–10）分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），17–11、17–12式相加即得叶绿素总