基因工程的基本操作程序 上课用课件.ppt

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1、1.2基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定1）从基因所在的生物体直接获取利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成2）mRNA反转录成cDNA目的基因的获取4)从基因文库中获取目的基因②用__________切割目的基因，使其产生。①用一定的切割质粒，使其出现一个切口，产生_________。(基因工程的核心)③将切下的目的基因片段插入质粒的_____处，再加入适量__________，形成了一个重组DNA分子(重组质粒

2、)。限制酶黏性末端同种限制酶同种黏性末端切口DNA连接酶基因表达载体的构建（一）构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（二）构建零件及其作用①目的基因②启动子基因表达载体的组成RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。③终止子④标记基因一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因

3、的细胞筛选出来。常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。受体细胞稳定表达将目的基因导入受体细胞方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入受体细胞(检查是否成功)分子水平检测个体水平鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录

4、出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA分子杂交DNA分子杂交抗原-抗体杂交目的基因的检测与鉴定目的基因主要是指_____________________。编码蛋白质的结构基因供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来从基因所在的生物体直接获取mRNA互补DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基

5、因。逆转录酶DNA聚合酶mRNA反转录成cDNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因核苷酸序列目的基因化学合成根据已知的氨基酸序列合成DNA：人工合成目的基因推测推测从基因文库中获取目的基因1.基因组文库将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。用适当限制酶切

6、割与载体连接导入受体菌群与载体连接导入受体菌群基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成该生物cDNA文库mRNA互补DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)逆转录酶DNA聚合酶（PCR，polymerasechainreaction）PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制原

7、理：前提：条件：聚合酶链式反应PCR扩增过程①DNA变性(90℃-95℃)：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成。②复性(55℃-60℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部。③延伸(70℃-75℃)：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板链互补的_______。氢键单链DNA双链DNADNA链易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上农杆菌特点：农杆菌转化法显微注射法含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫

8、转基因动物为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？显微注射分裂分化移植发育2.微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→_______细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态1.常用菌：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分