基因工程的基本操作程序（上课）.ppt

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1、基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等原核细胞的基因结构RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的

2、。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和

3、调节基因。（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。（目的基因）启动子与终止子启动子是在非编码区内，基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。终止子是在非编码区内，基因的尾端，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程的基本操作流程目的基因的获得从基因文库获得基因文库利用PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(cDNA文库)已知序列未知序列基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库基因组文库和部分

4、基因文库cDNA合成过程第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。寻根问底——（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以

5、通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。PCR基本操作过程：高温（90-95摄氏度）变性DNA解链低温（55-60摄氏度）复性引物结合中

6、温（70-75摄氏度）延伸互补链的合成PCR基本操作条件：解旋酶、引物、热稳定聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸、DNA母链构建表达载体（核心）表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。基因工程载体的构建需要考虑哪些

7、因素（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的

8、启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）显微注射法1.提纯2.取卵3.注射4.移植将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）Ca2+处理感受态大肠杆菌细胞目的基因