植物组织或器官中丙二醛含量测定.ppt

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1、植物组织或器官中丙二醛含量的测定制作人：刘新单位：生命科学学院植物生理学教研室一、实验目的1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。2.了解丙二醛积累对细胞的伤害二、实验原理：硫代巴比妥酸TBA丙二醛3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川）逆境膜脂的过氧化作用丙二醛酸性粉红色三、实验材料：受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：实验仪器：紫外可见分光光度计离心机四、实验步骤：1MDA的提取称2g叶片，加入5ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴

2、中研磨提取，匀浆液以12000g离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。2MDA的测定取1mlMDA提取液，加3ml27％三氯乙酸和1ml2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。五、结果计算以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。分别计算衰老和对照组的值。MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450MDA含量(μmol/

3、gFW)＝D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。六、注意事项：0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）可溶性糖与TB

4、A显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。思考题：1.通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？2.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。3.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？4.为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？5.丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？6.如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？7.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。