动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进

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1、动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进【摘要】目的初步探讨糖类物质对肝组织中丙二醛（MDA）含量测定的干扰并改进测定方法。方法该实验以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，通过葡萄糖在450nm和532nm处吸光度值的正相关关系建立直线回归方程，校正MDA在532nm处的吸光度值。计算出样品中MDA含量。结果肝组织中糖类物质会干扰MDA含量的测定，尤其是当样品中糖量含量间差异较大时，糖的干扰可能导致对机体受损程度的错误评判。结论改进后的方法更为科学、准确，可应用于动物肝组织丙二醛含量的测定。【关键词】丙二醛；灵芝多糖；葡萄糖；直线回归法丙二醛（Malomdi

2、aldehvde，MDA）是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成的脂质过氧化物，测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［1］。传统的测定方法是利用过氧化降解产物中的丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）在高温和酸性条件下缩合，形成的红色产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）于532nm处有最大吸收峰来进行测定的。这种方式常常受到多种物质不同程度的干扰［2］。其中最主要的干扰因素是组织内的可溶性糖。动物肝组织中含有大量的肝糖原，在测定时降解的葡萄糖会干扰测定。而探讨动物组织中糖类物质对MDA测定的干扰及消除方

3、法还未见报道。本研究以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，初步探讨了葡萄糖对肝组织中MDA含量的测定的干扰并改进了测定方法。　　1材料　　1.1动物清洁级昆明种雄性小鼠，18～20g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究中心提供。动物饲养室温度为22～25℃，湿度为65%～80%。　　1.2试剂丙二醛（MDA）测定试剂盒，购于南京建成工程研究所。其它化学试剂均为分析醇。　　1.3仪器752型紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；飞鸽牌TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；解剖剪。　　2方法　　2.1动物分组及给药清洁级昆明雄性小鼠48只，

4、体质量18～20g。参照　　2.6两种方法测定　　小鼠肝组织MDA含量的比较方法1：步骤同试剂盒说明书所述一致，各组小鼠肝匀浆样品显色后测定450nm、532nm波长下的吸光度值OD450、OD532，根据直线回归方程求出各样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532。D532与Y532之差即是MDA-TBA反应产物在532nm下的吸光度值，用该值进一步计算得到样品中MDA含量。　　方法2：以试剂盒上提供的传统方法测定MDA含量。　　3结果与分析　　3.1小鼠肝组织中糖类物质的含量　　经过多糖灌胃的小鼠，其肝组织中糖类物质的含量均比对照组小鼠高。CG组、H

5、G组、MG组、LG组小鼠肝组织中糖类物质的含量分别为(36.45±6.70),(47.05±9.57),(40.15±2.34),(38.64±9.41)mg/g。小鼠肝组织糖含量在对照组与试验组之间存在着较大差异。　　3.2葡萄糖对TBA反应的影响测定　　3.2.1葡萄糖与TBA反应的比色测定　　葡萄糖与TBA反应产物的吸收光谱如图一所示，反应产物在400～600nm处均有吸收值，其中在450nm处有峰值吸收。而赵世杰等［6］的研究表明，MDA与TBA显色反应产物在450nm处无吸收。因此可以在450nm测定吸光度值计算葡萄糖的含量，从而消除葡萄糖对M

6、DA-TBA显色反应的干扰。　　3.2.2MDA-TBA反应中糖类物质干扰的排除(直线回归法)　　图2显示了葡萄糖与TBA反应产物在在450nm，532nm处吸光度值间的相关关系。不同浓度的葡萄糖与TBA反应产物在450nm处的吸光度值与532nm处的吸光度值成正相关，相关系数达到0.9998。其直线回归方程为：Y532=0.3284+0.0017OD450。样品显色后测定450nm、532nm波长下的吸光度值，根据方程求出该样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532，测定MDA含量时，通过校正，即减去Y532，可进一步计算样品中MDA的准确含量。　　3

7、.2.3MDA测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响　　反应体系中的葡萄糖来自于肝组织中的糖原在一定条件下的降解。因此，肝糖原的降解程度与葡萄糖对MDA含量测定的干扰程度紧密相关。图3反映了MDA测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响，对照组样品未经过高温和酸解，其还原糖的含量明显低于处理过的样品的还原糖含量。这说明高温和酸性条件下，肝组织中的糖原会降解为具有还原性的葡萄糖。水浴时间的延长，并没有改变样品中还原糖含量，这说明糖原物质的分解进程较快。因此反应时间对于MDA含量的测定没有较大影响。　　3.3两种方法测定的小鼠肝组织MDA含量的比较　　分别采用两种

8、方法测定的小鼠肝组织MDA含量，结果如表1所示。糖类的存在对肝组织MDA含量的测