课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件.ppt

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1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【课题背景】尿素的利用尿素CO(NH2)2尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2细菌启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。（一）筛选菌株1、实例：PCR（DNA多聚酶链式反应）科学家从热泉中发现的水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶一、研究思路2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止

2、其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、本实验所需的培养基特点：以尿素为唯一氮源缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，因缺乏氮源而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。实例：①以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离出分解尿素的细菌。②加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。③加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。④无氮源培养基可以分离固氮微生物。⑤石油是唯一碳源的培养基，可

3、以分离能消除石油污染的微生物。⑥培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。1、显微镜直接计数：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。（二）统计菌落数目*不能区分死菌与活菌；缺点：2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(平均菌落数÷涂布的稀释液的体积)×稀释倍数(3)注意事项①为保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布三个或三个以上的

4、平板，培养后计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因是：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。（三）设置对照主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。①判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。②判断选择培养基是否具有筛选作用：稀释倍数相同的菌液，接种在牛肉膏蛋白胨培养基上后培养观察菌落数目。如果菌落数明显多于选择培养基上的数目，则选择培养基起到了选择作用。本实验对照的设置：二、实验操作1、土壤取样土壤：“微生物的天然培养基”数量最大、种类最多。大约

5、70%—90%是细菌距地表3-8厘米的土壤先铲去表层土3cm左右，再取样。将样品装入事先准备好的信封中。制备牛肉膏蛋白胨培养基以尿素为唯一氮源的选择培养基。2、制备培养基每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。注意：应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行3、样品的稀释系列稀释法4、取样涂布作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板，培养并计算出菌落平均数。如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得

6、菌落数在30～300之间、适于计数的平板由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。细菌：104、105、106放线菌：103、104、105真菌：102、103、104分离不同的微生物采用不同的稀释度5、微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。菌落特征（鉴定菌种的主要依据）菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。6、计数在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数

7、目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶pH升高指示剂（酚红）将变红7、菌种鉴定鉴别培养基：。如大肠杆菌在含有伊红美蓝的培养基中，菌落会出现黑色。三、分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)无菌操作(2)做好标记(3)规划时间，提高工作效率(4)样品的稀释涂布(5)设置对照(6)平行重复原则(7)培养时间和温度(8)记录菌落特征