蛋白质浓度的测定方法总结.doc

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1、一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式   蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor（2）精确计算通过计算O

2、D280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：  蛋白质浓度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D  其中d为测定OD值比色杯的厚度  D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】 1.学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度计的操作方法。 【实验原理】 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。 紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速

3、，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。 【实验材料】 1.实验器材 试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。 2.实验试剂 (1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。 (2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。 【实验操作】 1.绘制标准曲线 取7支试管按下列各表加入各试剂： 管号 0123456试剂标准蛋白质溶液(ml)0.00.51.01.52.02.53.0蒸馏水(ml)8.07.57.06.56.05.55.0蛋白质浓度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.62

4、50.750试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。 2.测定未知样品 取样品溶液4毫升,加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。【实验结果】 根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。三．双缩脲法（Biuret法）

5、实验原理　双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9L'B  P  n!试剂与器材#S;d(z/I+M(h3C6}    试剂：'T!`$d3V,J%A（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛

6、血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05NNaOH配制。1^)^+}:~1L2~  N"?6C（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试

7、剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。-P(C4v(K6@/{器材：)m,W4G%C9~,w)O1.可见光分光光度计)q  A4S8X9t,n2.比色杯!l#T#q;g*G  e3.大试管15支+

8、/Y-a3P+d&H4-v4.旋涡混合器等。:P'h/f:h(e4u/d%o%^-B操作方法2G0?3_+^-h)F  V1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，