实验五 蛋白质浓度测定方法比较

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1、实验五蛋白质浓度测定方法比较一．实验目的：了解蛋白质浓度的测定方法(Lowry法、紫外线吸收法和考马斯亮蓝显色法)，并比较它们的优缺点。二．Lowry法（Folin-酚法）：1．实验原理：OH－　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　磷钼酸、磷钨酸　Pr+CuSO4　　Pr-Cu络合物（紫红色）　　　蓝色复合物　　蛋白测定范围：25-250ug/ml测定波长：660nm标准蛋白BSA250ug/ml2．试剂和器材：3．操作方法：（1）依次向各试管中加入试剂：管号1234567待测1待测2BSA(ml)00.10.20.40.60.81.01.01.0D.W(ml)

2、1.00.90.80.60.40.2000[Pr](μg/ml)02550100150200250试剂甲(ml)5.0室温反应10分钟(双缩脲反应)↓试剂乙(ml)0.5立即振摇,30摄氏度水浴20分钟↓A660nm00.0680.1400.2560.3550.5350.6510.3020.303（2）以A660nm-[Pr]作标准曲线：4．实验结果：从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：116μg/ml三．紫外线（UV）吸收法：方法一：作图法1．实验原理：利用蛋白质在280nm的紫外吸收特性(蛋白测定范围：0.1～1mg/ml)2．操作步骤：标准蛋白BSA1mg

3、/ml（1）向各试管中依次加入各种试剂：管号12345678待测1待测2BSA(ml)00.51.01.52.02.53.04.04.04.00.15MNaCL4.03.53.02.52.01.51.0000[Pr](mg/ml)00.1250.250.3750.50.6250.751A280nm00.0660.1420.2200.2920.3970.4430.5950.0850.060（2）以A280nm-[Pr]作标准曲线：4．实验结果：从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：0.128mg/ml方法二：经验公式法分别测出待测蛋白A260、A280　　蛋白质浓度

4、（mg/ml）＝1.45A280-0.74A260或蛋白质浓度（mg/ml）1.55A280-0.76A260一．考马斯亮蓝显色法（Brad-forol法）：1．实验原理：[Pr]CBBG-250-Pr复合物A595测定Pr范围：0~250ug/ml标准蛋白BSA250ug/ml测定波长595nm2．试剂和器材：考马斯亮蓝试剂；标准蛋白质溶液：250μg/mlBSA；测试样品试管及试管架，0.1及5ml吸量管，恒温水浴，722型分光光度计。3．操作步骤：（1）依次向各试管中加入各种试剂管号123456待测1待测2BSA(ml)00.20.40.60.81.01.01

5、.0D.W(ml)1.00.80.60.40.2000[Pr](μg/ml)050100150200250CBBG-250(ml)5.0A595nm00.2240.3590.4280.4510.4530.2970.309（2）以A595-[Pr]作出标准曲线：4．实验结果：从标准曲线上可求得待测蛋白浓度(平均)：117μg/ml五、试验分析：Lowry法是双缩脲法的进一步发展，是一种可靠的蛋白质含量测定法。优点是操作简便，灵敏度高，可测定范围25－250微克的蛋白质。缺点是有蛋白质特异性的影响，即不同蛋白质因酪氨酸，色氨酸含量不同而使颜色强调不同，标准曲线也不是严格

6、的直线形式。要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。紫外线吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。它的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。缺点是不同蛋白质中酪氨酸，色氨酸含量

7、不一样，测定结果误差大；核酸有强烈干扰；蛋白质紫外吸收值与PH有关。考马斯亮蓝法是检测生物制品总蛋白含量的理想方法，它方法简单，只需一种显色液；反应迅速，只需5分钟；干扰少。缺点是高浓度的EDTH,尿素，甘油等有干扰；PH值影响大；线性关系不好。