蛋白质的提取及浓度测定

《蛋白质的提取及浓度测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、浙江大学宁波理工学院生化分院实验报告专业：制药091学号：3090502111姓名：陈松泽实验蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，

2、蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂1.试验材料：萌发3天的小麦种子2.主要仪器：（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管（5）研钵（6）100mL容量瓶3．试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500mL）的溶液。四、操作步骤1．蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将

3、匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。2.标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/m

4、L）OD280nm1040 20.53.50.125 31.03.00.25 41.52.50.375 52.02.00.50 62.51.50.625 73.01.00.75 84.001.0 表1蛋白质标准曲线制作3.样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定2

5、80nm波长处的光吸收值，一般来说，1A280Unit≈1mg/ml(对于浓度位于0.02mg/ml~3mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度≈A205/31）对于存在核酸污染的蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280nm和260nm波长处的光吸收值，或280nm和205nm波长处光吸收值，按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）=[1.55×A280]－[0.76×A260]蛋白浓度（mg/ml）=A205÷(27＋A280/A205)度时乘

6、以稀释倍数。五、思考题1.为何要在280nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。优点：①.快速；②.对蛋白质无破坏性。缺点：①.不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此

7、法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）②.核酸可引起强烈干扰。灵敏度：0.2mg/ml~2mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1ml。注意事项：实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml，这是非常不精确的。如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。2.如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？蛋白质浓度的实际的值要比测量值偏大。因为核酸里含有N（氮元素），而测量蛋白质浓度时主要就是测N（氮元素）的含量，所以核酸的存在会导致N（氮元素）含量的

8、增加，最终导致蛋白质浓度的测量值偏大。