鱼类细胞代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数.doc

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1、血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。血清为临时添加，终浓度为20%。巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml=10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。使用时每1ml加10μL即100μg/mL。剩余-4°冻存。鉴于各组分均为使用时添加，

2、故不进行单独过滤除菌。培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。PBS：NaCl:8g；KCl:2g;Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）;KH2PO4:0.2g加水定容至1L，高压灭菌。操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为1

3、0%MTT：取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。使用时用PBS稀释至0.4%。1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次

4、性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。试剂为肝素钠抗凝剂、DMEM培养基、血清、双抗（自配10,000ug/ml）、0.01%高锰酸钾、丁香酚（丁香酚：无水乙醇=1：1）2.1.1麻醉取血鱼体用0.01%高锰酸钾溶液浸泡消毒0.5h，滴入适量麻醉剂使其麻醉，取出喷75%酒精以无菌纱布擦拭体表，移至超净台内，以5

5、mL注射器吸取0.1mL肝素钠抗凝剂，而后垂直由腹端插入臀鳍腋下直至血管进行取血。每尾取血2ml左右，装于无菌2mlEP管中。加入20ul甘油或DMSO，血液冻存于-4°冰箱。2.1.2细胞培养采用0.01mM2-巯基乙醇作为培养基添加因子，另外加入20%FBS。染色须用30mm培养皿+入盖玻片，每个1.5ml培养基+60ul血液，共设置4组，每组3个进行Wright-Giemsa染色，观察细胞形态进行细胞分类的鉴定。剩余2组进行台盼蓝染色，测定细胞存活率。（此步盖玻片须用强酸泡洗）MTT采用2个96孔板，每孔100ul，细胞浓度理论上为104-105/ml.设置：置0组，对

6、照组，LPS组，ConA组，PHA组终浓度均为0.3mg/ml。另外采用培养瓶培养每组3个共12个，以备实验用。0.4ml血液+10ml培养基。每瓶加入3ml培养基，随后加入35ul双抗，0.75ml血清。培养瓶装入餐盒后置于烘箱内室温培养。0.3mg/ml的PHA和0.3mg/ml的ConA做刺激源，0.1mM的2-巯基乙醇接种时另取一EP管，加入2mlPBS，80ul血液，细胞计数。2.1.3细胞检测：染色检测（Wright与Giemsa染色）可检测细胞类型；MTT检测、细胞计数检测可检测细胞增殖2.1.3.1Wright-Giemsa混合染色取两样各0.5g，甲醇500

7、ml，配成混合染液，将盖玻片浸入95%酒精固定15min，PBS洗两次，每次1min，盖玻片浸入含染液的培养皿中，静置1min，取出浸入染色液与ddH2O按1:2体积的培养皿中，静置15min，自来水冲洗经70%、80%、90%酒精各一次，95%2次，100%3次，每次1min二甲苯透明3次，每次1min，低价中性树胶，封片2.1.3.2MTT检测1:收集血细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2:5%CO2，37℃孵育，至细