细胞复苏、培养、传代、冻存、细胞计数和MTT.ppt

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1、细胞复苏、培养、传代、冻存、细胞计数和MTT佳木斯大学张明磊细胞复苏细胞冻存管从-80℃取出，迅速置于37℃水浴锅中于1min内迅速融化至室温。培养于操作台内混匀后吸出冻存细胞液移至15ml离心管中，1500rpm3min(1000rpm5min)。吸弃培养液，加入新鲜培养液，重悬混匀。向新培养瓶中加入新培养液铺满瓶底后取重悬液加入其中，于37℃5%CO2中培养。传代将80%汇合或刚汇合的细胞，PBS洗2次吸弃后，加入TRY消化，翻转观察当消化液消化至细胞间隙变大或呈沙状流下时加入2~3倍体积的培养

2、液终止消化。将细胞冲刷下混匀后，移至15ml离心管1500rpm离心3min。吸弃培养液，重悬混匀，进行传代、计数后可冻存每管细胞10*6-7个/ml或接种到96孔板、6孔板中进行实验。细胞计数板细胞计数板使用前准备：计数板和盖玻片用75%乙醇喷洗后擦干净将其置于倒置显微镜下调整视野100ul25X16细胞计数板S=1.0mm2H=0.1mmV=0.1mm3=0.1ul细胞计数25×16型的计数板将计数室放大，可见细胞个数／1mL=8个体积为0.1ul的方格的细胞总数/8*10-4×稀释倍数（稀释倍

3、数常为8，即700ulPBS+100ul细胞重悬液）计数原则：上计下不记，左记右不记。细胞数/ml=查得细胞数（万）个/ml实验应用取细胞悬液=所需细胞数所需细胞数×1ml=×1000ul查得细胞数查得细胞数如：96孔板接种A375细胞，4500个/孔所需细胞数=4500个/孔×60孔=270000个=27万查得细胞数=360万取细胞悬液（ul）=27万/360万×1000=750ulMTTMTT全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT

4、浓度为5mg/ml:称取MTT0.5g，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤除菌分装，-20保存备用(注：保存在包邮锡箔纸的离心管中，配制和使用时关闭操作台灯源)。MTT比色法是检测细胞存活和生长的方法（是相对值，且A在0.3~0.7范围内）。MTT原理MTTDMSO酶联免疫检测仪在490nm波长处测光吸收值A(0.3~0.7)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，可间接反映活细胞数量,。MTT操作步骤接种细胞：细胞悬液，每孔1000-10000个/200ul胞接种到96孔板，

5、设5个复孔。加100ul培养液在垂直悬空加100ul细胞悬液。分组给药：分阴性对照组（K）、阳性对照组（E2）、给药组（10-4~10-9）。培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。呈色：培养3-5天后，20ul/孔5mg/mlMTT溶液。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪(预热30min)上测定各孔光吸收值，SPSS分析数据。