RD细胞复苏、传代、冻存.docx

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1、RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。   1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。   2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于3

2、7℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。   3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。   4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。22

3、.4min1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。   3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。2