普通微生物学实验02--细菌革兰氏染色与霉菌形态观察.pdf

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1、实验二微生物的染色与形态观察细菌染色原理在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料样是种盐和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（mmethylenebluechlorideethylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：MBC→methyleneblue++chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystalviolet）、碱性复红

2、（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。革兰氏染色1884年，丹麦医生革兰(C.Gram)发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。把几乎所有的细菌分为：革兰氏阳性菌（G＋）革兰氏阴性菌（G－）。结果结果::革兰氏阳性菌——紫色革兰氏阴性菌——红色G+和G-细胞壁结构比较革兰氏染色原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时

3、，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏染色的意义对于实验的指导革兰氏阳性细菌不容易进行基因操作，难以用转化的方法导入外源DNA。进行基因组提取的时候需要用溶菌酶进行细胞壁裂解。临床意义其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌2.选择药物3.与致病性有关：

4、：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。革兰氏染色基本步骤基本步骤：涂片固定——结晶紫初染——碘液媒染——95%乙醇脱色0.5min——番红复染1min结果:革兰氏阳性菌——紫色革兰氏阴性菌——红色革兰氏染色步骤结晶紫初染（1~2min）水洗碘液媒染（~1i1min）水洗95%乙醇脱色（20~30s至流出酒精刚刚不出现颜色）立即水洗番红复染（2~3min）水洗干燥注意事项不要取过多的菌体，细菌数量巨大，取少许足够实验观察，并且效果更好。严格按照说明进行染色，尤其是乙醇脱色步骤，20~30s后立即用清水冲洗。不

5、要用水直接冲洗菌膜。不要用滤纸直接接触菌膜吸水。滴加的任何溶液最好不要直接接触，而是应该悬空滴加，或者用一次性枪头加。霉菌形态观察实验原理：制片时，常用乳酸石碳酸棉兰染液，做成水浸片进行观察，该染色液是霉菌制片中常用的固定液，可以使菌丝分散，细胞不易变形，并具染色、杀菌作用。乳酸石碳酸棉兰染色液：石碳酸20g，乳酸20mL20mL，甘油40mL40mL，棉蓝005g0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其它成分，微加热使其溶解，冷却后用。霉菌形态观察曲霉根霉青霉曲霉显微镜操作目镜物镜载物台聚光镜细准焦螺旋粗准焦螺旋照明器奥林巴斯生物显微镜

6、取镜对光低倍镜观察：把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔。转动粗准焦螺旋，顺时针旋转，使载物台上升，直到物镜接近玻片标本（~0.5cm）为止【注意：此时眼睛一定要看着物镜！】。观看目镜，用粗准焦螺旋逆时针方向降低载物台至视野内出现物象后，改用细准焦螺旋调至视野出现清晰物象，并将最好部位推至视野正中央，准备换高倍镜观察。高倍镜观察：将高倍镜（40X）转至镜筒下方，操作时要从侧面注视，防止镜头与玻片相撞。调节光圈和聚光镜使光线亮度适中。观察时先用粗准焦螺旋慢慢下降载物台至发现物象，再用微准焦螺旋调至物象清晰为止。仔细观察后，移动最好部

7、位至视野中央，准备换油镜做进一步观察。油镜观察：细菌或其他标本的细微结构都需要用油镜（90X或100X）观察。显微镜操作注意事项1、必须遵守操作规程，严格认真地按要求操作。取送显微镜时，应右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。切勿用一只手斜提，前后摆动，防止目镜滑出跌落。2、保护好镜头，揩试目镜、物镜上的灰尘或污物，必须使用专用的擦镜纸。切勿用手指、手帕、纱布和普通纸擦。3、物镜镜头的切换一定要使用转换器，以免使镜头脱落和损坏。4、转动粗、细准焦螺旋时，不要用力过猛，以防止机件损伤，调节失灵。5、镜检时，坐姿端正，一般用左眼观察物象，用右眼看着实