细菌地简单染色和革兰氏染色及其形态观察.doc

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1、细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.目的要求（1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。（2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。（3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。2.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜

2、下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内

3、而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。　　革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被

4、脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。3.材料及器材(1)大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(2)革兰氏染色液，载玻片，显微镜等4.方法与步骤Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。Ⅱ干燥室温自然干燥。Ⅲ

5、固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。Ⅳ染色（1）简单染色法：①染色滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。②水洗倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。③干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。④镜检涂片干燥后镜检。（2）革兰氏染色法：①初染加草

6、酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。②媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。③脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。④复染用番红液染1～2min，水洗。⑤镜检干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。(3)混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱

7、色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。革兰氏染色过程：1.实验作业(1)在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？(2)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？