PCR技术操作注意事项.ppt

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1、PCR的注意事项PCR的定义全称：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称：PCR是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。常见问题！！！问题1：无扩增产物原因现象对策问题2：非特异性扩增现象原因对策问题3：拖尾现象原因对策问题4：假阳性现象原因对策现象：正对照有条带，而样品则无■原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓

2、度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换B

3、uffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存