PCR的注意事项.ppt

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1、PCR技术注意事项引物的设计引物在PCR反应的浓度模板模板的种类模板变性温度TaqDNA聚合酶使用注意事项PCR缓冲液使用注意事项PCR循环次数注意事项防止污染的方法引物类的注意事项寡核苷酸（dNTP）使用注意事项温度与时间的注意事项注意事项一、引物两引物间距离决定扩增片段的长度，*两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。引物的设计：1.长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆

2、和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。2.两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”。6.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。7.引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处3.(G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。4.引物内部应避免内部形成发夹结构5.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右引物在P

3、CR反应中的浓度1.一般在0.1～1μM之间。2.浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。3.一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。二、温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TawDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火

4、与延伸（此温度TawDNA酶仍有较高的催化活性）。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。②退火（复性）温度与时间：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的

5、引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。寡核苷酸（dNTP）在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性,高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，可降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。TaqDNA聚合酶由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDN

6、A。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。模板模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一模板变性温度*是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。*变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。*加入TawDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃，以保持DNA聚合酶的活力。PCR缓冲液:PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tr

7、is–Hcl缓冲液和1.5mMgCl。Mg2+的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR循环次数*常规PCR循环次数一般为25～40个周期。*循环次数过多，非特异性背景严