pcr技术原理与操作

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1、PCR技术原理与操作主要内容核酸的种类与功能DNA复制原理PCR发展简史PCR基本原理PCR体系各组分及作用PCR操作步骤及分析PCR技术的优缺点脱氧核糖核酸核糖核酸核酸核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中起着极其重要的作用。１、种类２、功能简称DNA简称RNA一核酸的种类与功能3、微生物分类（按核酸类型）（1）DNA微生物：细菌、寄生虫类（附红细胞体、弓形体）、衣原体、支原体DNA病毒疱疹病毒科:伪狂犬病毒、马立克病毒、传染性喉气管炎病毒和鸭瘟病毒；圆环病毒科：猪圆环病毒、鸡传染性贫血病毒；细小病毒科:猪细小病毒、犬细小病毒、番鸭细小病毒、鹅细

2、小病毒；痘病毒科：鸡痘、山羊痘和绵羊痘；腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒（2）RNA微生物RNA病毒正粘病毒科：流感病毒副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒弹状病毒科：狂犬病病毒、牛流行热病毒冠状病毒科：鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、SARSV黄病毒科：猪瘟、乙型脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒小核糖核酸病毒科：口蹄疫病毒披膜病毒科：猪繁殖与呼吸综合征病毒双RNA病毒：传染性法氏囊病毒反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒二DNA复制原理半保留复制1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶

3、延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……三PCR发展简史KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...三PCR发展简史Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着D

4、NA，……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖三PCR发展简史四PCR基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

5、这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。模板DNA95℃PCR原理PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR

6、过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍四PCR基本原理1、PCR体系组分引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）五PCR体系各组分及作用（1）模板模板作为DNA合成时的初始链，可以是DNA或cDNA分子，模板

7、需要量一般为102～105拷贝。（2）扩增缓冲液缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。10～50mmol/LTris-Hcl(pH8.3～8.8）（3）耐热DNA聚合酶催化PCR反应，该酶是从Thermusaquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；具有5′→3′方向的聚合活性和外切活性。2、各要素作用五PCR体系各组分及作用美国Y